活性维生素D3对糖尿病大鼠胰岛β细胞功能影响研究.docVIP

活性维生素D3对糖尿病大鼠胰岛β细胞功能影响研究 　　[摘要] 目的 研究维生素D3在高糖诱导的大鼠胰岛β细胞氧化应激中的作用。 方法 采用MTT比色法分析比较有无添加维生素D3对于不同浓度葡萄糖诱导的大鼠β细胞系min6细胞增殖率的影响，并使用酶联免疫法试剂盒检测胰岛素分泌情况。建立糖尿病大鼠模型模拟疾病进程，研究给药骨化三醇胶丸[0.008 μg/（kg?d）]对于大鼠血糖、体重变化的影响，并检测血清及胰腺中氧化应激标志物丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）表达情况。 结果 维生素D3可以保护高糖诱导的大鼠胰岛β细胞损伤并且抑制β细胞中胰岛素的分泌。动物模型实验显示，给药骨化三醇胶丸对于糖尿病发生及进程影响不大，但是有助于改善糖尿病引起的大鼠体重减轻。对于血清及胰腺MDA和GSH-Px的检测发现，骨化三醇胶丸有助于改善胰腺氧化应激状态并减少胰腺损伤。 结论 维生素D3可以减少高糖诱导的大鼠胰腺β细胞损伤，并且在糖尿病发生过程中减轻胰腺氧化应激状态，减少胰腺损伤。 　　[关键词] 维生素D3；胰岛素分泌细胞；氧化应激 　　[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（c）-0027-04 　　2型糖尿病是一种具有明显遗传倾向的多基因调控疾病，其发病机制十分复杂，且受到遗传因素和环境因素等多因素的共同影响。早期实验研究发现，钙磷代谢中的重要调节剂维生素D3在Ⅱ型糖尿病的发生发展中起一定作用。流行病学调查发现，人群中维生素D受体基因的多态性与糖尿病的发生存在一定相关性。 关于胰岛β细胞的分子生物学研究显示，胰岛素的分泌过程依赖于β细胞内外的钙离子浓度及胞内钙信号的活化。另外，维生素D3还具有免疫调节功能，可以有效地抑制自身炎症反应对胰岛组织的破坏及淋巴细胞浸润。 在临床上给予维生素D3和钙剂有助于缓解糖尿病及其并发症症状。但是，维生素D3在糖尿病发生早期事件中的作用尚不明确。维生素D3及钙剂是否有助于预防2型糖尿病的发生，尚缺少直接的实验证据证明。本研究旨在通过体外细胞实验及动物模型水平验证维生素D3在高糖高脂诱导的大鼠胰岛β细胞急性氧化应激中的作用，并探究维生素D3预防糖尿病发生的可能机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　试剂及仪器：大鼠β细胞系min6购于中科院上海细胞库；SPF级SD大鼠及实验动物高脂饲料购于上海斯莱克实验动物中心；高糖型DMEM培养基及胎牛血清购于美国Hyclone公司；鼠胰岛素酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于美国Linco公司；BCA蛋白检测试剂盒购于Thermo公司；丙二醛（MDA）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒购于上海舜田生物科技有限公司；链脲佐菌素（STZ）及维生素D3购于Sigma-Aldrich公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 MTT法检测细胞存活率 取对数生长期细胞接种于96孔板，分为对照组[磷酸盐缓冲液（PBS） 处理]及维生素D3处理组[10 nmol/L 1，25-（OH）2-VD3]，分别加入不同浓度（0～10 mmol/L）的葡萄糖溶液诱导细胞应激凋亡。培养48 h后用PBS溶液冲洗两次，每孔加入MTT 100 μL （1 μg/μL），37℃孵育1 h加入二甲基亚砜 100 μL溶解后使用酶标仪检测每孔490 nm处吸光度（A值）。各组细胞增长率（%）=（各组A值-空白组A值）/（正常细胞组A值-空白组A值）×100%。实验重复3次，取均值计算细胞存活率。 　　1.2.2 胰岛素检测 细胞胰岛素检测采用ELISA法，取对数生长期细胞接种于96孔板，使用含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的碳酸氢盐缓冲液（KRBB）冲洗细胞两次。 分为对照组（PBS 处理）及维生素D3处理组[10 nmol/L 1，25-（OH）2-VD3]，分别加入不同浓度（0～10 mmol/L）葡萄糖溶液，37℃培养1 h后收集细胞上清，使用鼠源胰岛素ELISA检测试剂盒检测胰岛素分泌量，均按说明书规范操作。 　　1.2.3 STZ及高脂饮食诱导SD大鼠糖尿病模型 选择SPF级6～8周龄，体重200～250 g的雄性SD大鼠共40只，随机平均分成对照组及罗盖全处理组。大鼠饲养于清洁级动物房中，禁食8 h后麻醉，按50 mg/kg舌下注射5% STZ 柠檬酸溶液（pH=4.35）。 罗盖全处理组术后每日使用骨化三醇胶丸（通用名：罗盖全，0.008 μg/kg）灌胃。对照组灌胃等量PBS溶液。 术后给予高脂饮食饲喂8周诱导糖尿病发生，每隔7 d采集尾静脉血检测空腹血糖变化并称量体重。 　　1.2.4 胰腺谷胱甘肽过氧化物酶活力测定 取0.5 cm×0.5 cm胰腺组织块置于冰上加入1 mL 裂解液 （