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细胞支原体巢式PCR检测方法建立及应用 　　摘要：动物生物制品生产过程中细胞（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。细胞支原体污染可显著影响生产用细胞的培养及生物功能的发挥，最终影响生物制品的生产，给生物制品企业造成巨大损失，建立高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要。建立了一种支原体巢式PCR检测方法，该方法高效、快速、灵敏，可以最大限度降低假阴性和假阳性结果的出现。该方法的建立对培养细胞、动物疫苗等生物制品企业的检测标准化管理有一定的借鉴意义。 　　关键词：支原体；细胞培养；巢式PCR；生物制品 　　中图分类号：S858.28；Q95 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0690-03 　　细胞培养过程中支原体污染主要来源于所使用的动物源的一些培养材料，如血清、已被支原体污染的细胞株（系）或者是经操作人员传播。污染培养细胞的支原体一般有寄生于人、牛、猪或狗的少数几种类型。细胞培养液中支原体的浓度可达1×107个/mL，而不管是肉眼观察还是普通显微镜下观察，受支原体污染的细胞状态并无明显变化[1]。但是，越来越多的研究表明，支原体感染发生后能改变细胞的DNA、RNA及蛋白表达，使研究结果的真实性和可靠性大大下降[2，3]。由于竞争营养及支原体有毒的代谢产物，支原体污染可显著影响生产用细胞的培养及相应生物学功能的发挥，影响生物制品的质量。细胞被支原体污染长期困扰着疫苗（特别是生产弱毒苗）的生产企业，增加了企业生产、投资的风险，特别是在竞争日益激烈的当代社会，这种风险对疫苗生产企业来说通常是致命的。因此，建立一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要。 　　目前，普遍公认的细胞支原体污染检测方法为分离培养法，该方法耗时、敏感性低，甚至可能出现二次污染，影响结果的判断。随着分子生物学的发展，PCR方法已经成为一种常用的有效检测培养困难和抗原性复杂的微生物的方法[4，5]。本研究建立了一种细胞支原体巢式PCR检测方法，最大限度降低了假阴性和假阳性结果的出现，以期为完善细胞支原体的检测提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试菌种：猪肺炎支原???（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）济南系强毒（菌号CVCC354）购自中国兽医药品监察所。 　　供试试剂与仪器：Taq DNA polymerase（2.5 U/μL）、10×PCR Buffer、dNTP（2.5 mmol/L）、DNA凝胶回收与纯化试剂盒购自武汉天源生物技术公司，对比用支原体PCR检测试剂盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）由以色列BI公司生产。9700型PCR 仪由美国ABI公司生产。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PCR引物 根据12种常见类型支原体（M. hyorhinis、M. orale、M. hyopneumoniae、M. arginini、 　　1.2.2 PCR检测方法的建立 　　1）阳性PCR模板的制备：将猪肺炎支原体培养液沸水水浴10 min，再3 000 r/min离心10 min，取上清液作为支原体阳性PCR扩增的阳性模板。 　　2）阳性支原体的检测：第一轮PCR反应体系25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，阳性引物Myc-F1和Myc-R1（10 μmol/L）各0.5 μL，阳性模板1 μL，Taq DNA 酶（2.5 U/μL） 0.25 μL，加ddH2O至25 μL。同时以ddH2O为阴性对照。反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 10 min。第一轮PCR反应结束后，取1 μL PCR产物作为第二轮PCR反应的模板，反应体系其他成分及反应条件同第一轮PCR。分别取第一轮和第二轮PCR反应产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后对目的片段进行纯化，作为PCR阳性模板备用。 　　3）阳性Mhp模板稀释倍数的确定：按1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6浓度梯度稀释Mhp阳性产物，固定体系其他成分不变进行PCR反应。反应结束后，取10 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，选择最适浓度作为Mhp阳性标准品。 　　4）反应条件的优化：Taq DNA 酶最适使用量的确定，按最适引物浓度，优化Taq DNA 酶 （2.5 U/μL）的使用量，分别为0.125、0.25、0.5 μL；dNTP最适使用量的确定，反应体系中dNTP（2.5 mmol/L）的使用量分别为1、2、3 μL。反应体系中其他成分和反应条件均不改变。反应结束后，取PCR反应产物5 μL进行1%