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一种改进自体表皮细胞悬液制取方法 　　[摘要]目的：探讨新的自体表皮细胞悬液制取方法。方法：选取30只大鼠，应用切削皮法结合胰蛋白酶和组织微粒法结合中性蛋白酶/胰蛋白酶法两种技术获得自体表皮细胞悬液并进行细胞产量和活力的比较。结果 实验组整个操作约1h内即可完成，而对照组则需要1.5天的时间。实验组活细胞率0.966±0.35，对照组活细胞率0.971±0.42，两组间比较无明显差异（P0.05）。细胞产量：实验组（1.5±0.52）×106，对照组（1.9±0.72）×106，两组间比较有无差异（P0.05）。结论：切削皮法结合胰蛋白酶法制取表皮细胞悬液，制取的表皮细胞悬液的产量和活力与组织微粒法结合中性蛋白酶/胰蛋白酶法比较无显著差异，但操作简单和耗时少。 　　[关键词]表皮细胞；悬液；细胞活力； 胰蛋白酶 　　[中图分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）19-1615-03 　　自体皮片移植是皮肤创面修复的重要手段，供皮区的瘢痕、感染和色素异常并发症的难题一直未得到解决，尤其大面积深度烧伤患者因为供皮区域限制等问题，促进了自体表皮细胞悬液的出现，并开始应用于创面治疗，但是临床应用效果不佳[1]。1975年培养自体表皮细胞成功[2]，由于培养的自体表皮细胞不但需要2周左右实验室培养时间，而且需要昂贵的实验室和技术熟练的专业人员，最重要的是经过培养的表皮细胞成功移植后存在组织脆弱，抗感染能力差等问题，所有这些缺陷限制了其临床应用[3-4]。因此开发一种技术简单，耗时少、产量高和活力好的自体表皮细胞悬液制取方法是烧伤和整形外科的研究热点。本研究对切削皮结合胰蛋白酶法和组织微粒结合中性蛋白酶/胰蛋白酶法两种技术获得自体表皮细胞悬液进行了比较，为临床应用奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1动物与分组：选取成年健康 Wistar 大鼠 30 只，体重200～300g，雌雄各半，术前禁食6h，予以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉（供皮区选择正常的背部两侧皮肤，固定好大鼠，消毒后，刮除背部鼠毛，形成约2cm×2cm无毛区，周围用胶带粘贴。用碘伏常规消毒正常皮肤3次，设计切取皮片范围1.0cm×1.0cm，皮下注射生理盐水使供皮区皮肤明显肿胀并形成一个相对的平面，取无菌一次性剃须刀片，中号直血管钳夹刀片，切下表皮，取皮片的厚度在切削时应密切观察。或者辊轴取皮刀切取刃厚皮片，取下的皮片立即放于生理盐水浸洗3遍备用，供皮创面，无菌凡士林油纱覆盖，无菌敷料加压包扎。 　　1.2酶消化：实验组：无菌条件下，将浸洗后皮片放入无菌容器中，组织剪简单剪碎皮片至1.0mm×1.0mm，加入适量无菌0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液，37℃消化20min后，无菌条件下离心收集上层表皮细胞悬液。对照组采用，无菌皮片浸于Dipase I 溶液，4℃消化过夜，镊子分离表皮细胞，生理盐水漂洗3遍，0.25%胰蛋白酶和 0.01% EDTA混合液，37℃消化10min，吸管反复吹打分散细胞，收集表皮细胞悬液[5]。 　　1.3细胞活力测定：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀。在3min内，分别计数活细胞和死细胞。OlympusIX71倒置显微镜镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。血球计数板法进行细胞计数，并统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。 　　1.4统计学方法：采用SPSS16.0 统计软件进行分析，两组设计的计量资料采用t检验，计数资料用百分率表示，率的比较采用 χ2检验，P0.05，如图1）。 　　4.3 细胞产量：实验组（1.5±0.52）×106，对照组（1.9±0.72）×106，两组间比较有无差异（P0.05，如图2）。 　　3 讨论 　　表皮细胞悬液不仅可用于创面治疗，而且应用于白癜风等皮肤疾病的治疗，因此制取表皮细胞悬液的方法相关研究是烧伤和整形外科研究热点之一。综合文献报道的制取方法，目前主要步骤包括：取皮，剪碎，酶消化和获得表皮细胞悬液[4-6]。 　　首先，取皮方法主要有负压取皮，剃须刀切削法取皮，辊轴刀或者电动取皮刀取皮，手术刀切取全厚皮等。负压取皮法尽管损伤小，但是操作复杂，耗时长，并且移植后表皮细胞总成活率低，是因为负压吸疱对表皮角质形成细胞和黑素细胞的生理功能造成了一定的影响，影响了移植后细胞的存活[7]。至于手术刀切取全厚皮，损伤重以及不适合大面积取皮等缺点而限制了其的应用。而应用切削法直接切下薄层表皮，表皮细胞的各种生理功能并未受到影响，而且操作时间短。故本研究中采用该方法顺利取得皮肤标本，但操作过程中都要注意掌握深度，表皮移植术后应尽量减少运动，以免影响表皮细胞的成活。