不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达系统细胞抽提物活性的影响_王雪.docVIP

———————————————————————————————————————————————不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达系统细胞抽提物活性的影响_王雪 DOI：10.13523/j.cb 中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2011，31(1):46-50 不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达 * 系统细胞抽提物活性的影响 王雪 1，2 权春善 3＊＊ 王建华 1，2 范圣第 3＊＊ 北京100049) (1中国科学院大连化学物理研究所大连1160232中国科学院研究生院 (3大连民族学院生物化学工程国家民委-教育部重点实验室大连116600) 摘要无细胞蛋白表达系统由于能够有效表达膜蛋白等有毒性蛋白，因此近二十年受到了关注， 其蛋白表达产率有了显著的提高。细胞抽提物活性的高低是无细胞蛋白表达系统高效运行的关6-6-键，若找到简单易行的活性评估方法，将大大降低成本及时间。葡萄糖-磷酸脱氢酶(glucose-6-PDH)是糖代谢的戊糖磷酸途径中的关键调控酶，phosphatedehydrogenase，G-该酶可以被用来6-PDH的活性为指标对无细胞蛋白表达系统中的抽提物活性进行评估细胞抽提物的活性。以G-6-PDH活性评价体系对机械破碎、评价，并利用G-高压破碎以及超声破碎三种破碎方法进行了比得出了三种破碎方法的最佳破碎条件。机械破碎最佳破碎条件是5000r/min，用直径0．1mm较， 玻璃珠，破碎6次;高压破碎的最佳破碎压力为1300bar;超声破碎最佳破碎条件是功率强度为总功率的60%，破碎30次。酶活性测定结果显示机械破碎和超声破碎得到的抽提物活性比高压破碎得到的抽提物活性略高。关键词 无细胞蛋白表达系统 Q816 等等。选， 正是由于无细胞蛋白合成系统具有体内表达无可比拟的优点，在近二十年来，无细胞蛋白合成技术发展的非常迅速。通常细胞抽提物的制备步骤包括多次的离心及透析等步骤键因素。James等 ［2］ G-6-PDH破碎方法抽提物活性 中图分类号 无细胞蛋白表达系统是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物，能量以及其它辅助因子来合成蛋白质的体外蛋白表达系统。早在20世纪60年代，Nirenberg等［1］就利用大肠杆菌无细胞系统来分析遗传密码，研究mRNA是如何翻译成有活性的蛋白质。随着基因组学、蛋白质组学以及代谢组学时代的到来，无细胞蛋白表达系统凭借其优点在近二十年受到了研究者的广泛关注。与传统的活体表达蛋白相比，无细胞蛋白合成系统具有以下优点:(1)由于无细胞蛋白合成系统并不是在细胞中合成蛋白，因此在表达膜蛋白以及细胞毒性蛋白方面有明显优势;(2)可以直接以质粒或PCR产物为模板来表达蛋白质;(3)无细胞蛋白合成系统还能够表达含有非天然氨基酸的蛋白;(4)操作者可以直接对无细胞蛋白表达系进行蛋白筛统进行控制;(5)可以同时表达多种蛋白， 09-0210-21收稿日期:2010-修回日期:2010-*教育部科学技术重点资助项目(D ＊＊通讯作者，电子信箱:mikyeken@dlnu．edu．cn;fsd@dlnu．edu．cn ，耗时较长，因此能否制备高质量 的细胞抽提物成为制约无细胞表达能否顺利进行的关 ［3］ 考察了离心及透析次数对细胞抽 ［4］ 提物的影响，结果表明经过步骤简化后得到的抽提物的蛋白表达产率并未受到明显影响。同时，Kim等也对细胞抽提物的制备过程进行了优化，结果显示菌体细胞破碎后经过12000g离心10分钟得到的抽提物同样能够满足体外蛋白表达的要求。 虽然无细胞蛋白合成技术在近年来有很大进展，但是大部分的研究主要集中于如何提高蛋白合成的产率 ［5-7］ ［8-9］［10］ ，延长反应时间以及如何降低实验成本等 方面，并没有一种方法能够对获得的抽提物的活性进行直接评估。抽提物的活性高低直接与蛋白产率相 2011，31(1) 王雪等:不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达系统细胞抽提物活性的影响 47 关，如果能够在进行无细胞蛋白表达之前对抽提物活性进行评估，不仅能够避免时间和药品资源的浪费，也能够帮助科研人员及时找出影响蛋白表达的因素。葡6-6-phosphatedeh·rogenase，萄糖-磷酸脱氢酶(glucose-G-6-PDH)是糖代谢的戊糖磷酸途径中的一种重要的酶，戊糖磷酸途径是微生物中普遍存在的一条糖的分解代谢6-PDH活性的大小通常被用来指示细胞