基于目标物诱导置换的腺苷无标记电化学检测研究..docVIP

第5章 基于目标物诱导置换的腺苷无标记电化学检测研究5.1 前言核酸适配体能与包括蛋白质、小分子甚至细胞等在内的各种靶分子高特异性的结合，作为一种新的识别元件，在蛋白质分子、疾病诊断及新药筛选等方面有着广阔的应用前景。到目前为止，已有大量的核酸适体作为识别探针用于各种分析物的检测[228,229]。由于核酸适体具有靶分子广泛，特异性强及易合成、易修饰，稳定性好等方面的优点，已引起化学界广泛的关注。在以核酸适体为识别元素的各种生物传感器中，基于电化学核酸适体的生物传感器凭借其高灵敏性和简单实用性，在蛋白质与小分子检测方面具有巨大的发展潜力。目前，大多数电化学适配体传感器的开发是基于目标物键合诱导适配体表面变构的换能策略[230,231]，使适配体上标记的氧化还原标记物与电极表面的距离发生改变，从而调节电流信号[147,149,150,232]。例如开发的基于目标物诱导链置换或分子信标变构开关的无试剂适配体传感器，已成功用于PDGF[147]、可卡因[149]，凝血酶[148,150,233]和ATP[231,232]等目标物的检测。这些传感器对于靶分子的检测具有较高的选择性和灵敏度，但在合成氧化还原标记的适配体探针时需要复杂的标记过程和特效试剂，从而限制了它们的常规应用。因此，应致力于发展无标记和低成本的适配体传感器[53,230,235]。本章中，我们设计了一种以腺苷为分析物, 基于目标物诱导适配体置换原理，以亚甲基蓝（MB）为电化学活性指示剂的无标记可再生型电化学适配体传感器。腺苷是一种内源性核苷，能参与血管神经舒张活动，具有抗心律失常的功效，且在中枢神经和周围神经系统信号表达中有着不可忽视的作用，能参与肌肉收缩和脑神经与视觉神经[236]血流量的调控，是一种高效的血管神经舒张药，有助于抵抗缺血性与疾病性神经伤害[237]。此外，腺苷还是细胞能源物质ATP的核心，增加腺苷在大脑中的含量能使人进入睡眠状态，同时其在免疫系统中也有着重要作用[238]。故研究腺苷的检测方法具有重要意义。亚甲基蓝是一种电化学活性物质，已报道能够以不同的方式与单链DNA和双链DNA相互作用[187]。它不仅能够嵌入核酸双链中，还能与鸟嘌呤碱基键合[187，239，240]。由于亚甲基蓝的峰电流能够反映杂交反应的程度，它在构建电化学DNA传感器[101,174,241]和基于分子信标变构开关的适配体传感器[148-150,242]中得到广泛应用。鉴于亚甲基蓝的低成本和良好的氧化还原特性，我们选择它作为该适配体传感器的电化学活性指示剂。适配体探针在与电极表面固定化的捕获探针发生杂交反应后,在亚甲基蓝溶液中的衡反应一段时间，即可获得适配体传感器。在腺苷的存在下，腺苷与适配体之间的特异性亲和反应会将适配体探针从其与捕获探针的双链模式中置换下来，导致传感界面上双链量的减少，从而使作用的亚甲基蓝量相应减少，最终表现为电化学信号的降低。5.2 实验部分5.2.1 试剂文中所用寡核苷酸序列根据文献[230]设计，由宝生物公司（中国，大连）合成。两种寡核苷酸序列分别为：1）捕获探针：3’-SH-(CH2)3-TCT CTT GGA CCC-5’; 2）含32个碱基的腺苷适配体探针：5’-AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT-3’。腺苷、胞啶、尿苷和鸟苷均从Generay Biotech Co., Ltd.购得。巯基乙醇（MCE，98%，Sigma Aldrich公司），1，6-巯基己醇（HDT，≥97%, Fluck, Switzerland），亚甲基蓝（MB，长沙化学试剂公司）以及其他化学药品均为分析纯，未作进一步纯化。0.01 M PBS缓冲液(含10 mM Na2HPO4，10 mM NaH2PO4，0.1 M NaCl，pH 7.4)用于溶解各种浓度的样品及所有的DNA序列。实验用水为超纯水（Barnstead/Thermolyne 公司生产的超纯水机制得，电阻不小于18.3MΩ）。5.2.2 传感界面的制备金纳米颗粒的制备参照文献[243]的方法。玻璃器皿使用前均用新配制的王水溶液(HNO3/HCl, 体积比1:3)浸泡,再用二次蒸馏水彻底冲洗。在100 mL含0.01% HAuCl4的回流液快速搅拌下，向其中加入1 mL 1.0%的柠檬酸三钠溶液，使混合物再保持沸腾状态10 min，当溶液颜色变为深酒红色，即制得约20 nm的金纳米颗粒。将金电极先后用直径0.3 μM和0.05μM的氧化铝粉末抛光处理，再依次用二次水、乙醇、二次水分别超声清洗5 min。然后将电极在新制的piranha溶液中浸泡20 min，最后用二次水冲洗并用氮气吹干。 将清洗好的电极立即浸入5 mM HDT的乙醇溶液中，4°C反应1