第七部分__重组体克隆筛选和鉴定.pptVIP

第七章 重组体克隆的筛选和鉴定p205 第一节 载体表型选择法 2. pBR322抗菌素标记选择 3. 选择过程： （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法 2. 选择过程 第二节 根据插入基因的表型选择 2. 增加新性状 第三节 DNA电泳检测法 二、酶切电泳筛选法 筛选过程 三、PCR扩增检测法 第四节 核酸杂交检测法 二、核酸杂交检测方法P107 Southern blot 筛选结果 （1）原位杂交筛选P109 （2）R-环检测法 2. Northern blotting 第五节 免疫化学检测法 P206 四、免疫印迹（western blotting）法P109 ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： ③蛋白质电泳的分子量标准 ④凝胶中的蛋白质染色： 直接染色电泳结果 （2）Western blotting Western装置 ② Blotting ③ Blotting过程 ④结果 　Western blot 第六节 转译筛选法 二、转译筛选 三、杂交抑制转译法 2. 过程 四、杂交释放转译法 2. 过程 五、DNA-蛋白质相互作用筛选法 一般克隆与筛选策略 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 ②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 ④胸苷酸激酶的补救作用 （2）TK选择过程 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） DHFR+细胞 DHFR- 细胞 ② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救 （2）选择过程 3. 新霉素抗性基因（neor） ③ 新霉素抗性基因--neor （2）选择过程 4. 氯霉素乙酰转移酶（CAT） （5） CAT分析方法 二、植物转化体报道基因筛选法 2. 几种报道基因的作用原理 Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 转入萤火虫的luciferase的烟草 烟草叶片表达B型肝炎抗原 植物细胞中适用的报道基因 在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。 ② 免疫学检查： 用抗CAT的血清进行Western blot或ELISA，检查CAT的表达。 Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes. ① 分析乙酰氯霉素 （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 1. 报道基因（reporter gene) （4）其它 4-甲-β-D-葡糖醛酸 荧光产物 GUS GFP 紫外光照 发绿色荧光 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸 蓝色水解产物 GUS Dalton SDS PAGE 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1μg/带，但可褪色回收。 硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。 2）转到膜上进行染色。 1）直接染色 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 ① Western（转膜） 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物 PAGE胶 待测蛋白 显色 辣根过氧化物酶：HRPO 1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。 2）洗去未结合的一抗。 3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 Immuno Blotting 单抗blotting结果 　1　　　　2　　　　　　3 4 一、无细胞翻译系统 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。 借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。 适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的 甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 比较放射性 带纹的位置 载体+外源DNA 转录 与预期的产物分子量相符？ mRNA一旦与