2017-2018学年高中生物第六章蛋白质和DNA技术第二节DNA片段的扩增__PCR技术学案中图版选修1.docVIP

第二节　DNA片段的扩增——PCR技术 1．理解PCR扩增DNA片段的原理。 2．尝试PCR技术的基本操作和应用。 一、细胞内的DNA复制 过程：首先在解旋酶的作用下解开DNA双链；接着在RNA聚合酶的作用下，以DNA单链为模板，合成一段RNA引物（两条DNA模板链各需一个RNA引物）；然后以RNA引物为起点，在DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则合成两条新的DNA子链。 二、DNA体外扩增——PCR技术 1．概念：DNA体外扩增技术实际上是在体外模拟细胞内的DNA复制过程，形成大量特异性的DNA片段，这个反应过程称为聚合酶链式反应，简称PCR。 2．PCR过程与细胞内的DNA复制过程的区别 （1）PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20～30个脱氧核苷酸。 （2）PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。 3．PCR技术的操作 进行PCR过程前，将PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2＋等成分加入到一种特制的微量离心管中。 ①高温变性：把离心管置于95 ℃的高温中，DNA碱 基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成两条单链。 ②低温复性：将离心管置于55 ℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。 ③中温延伸：再将离心管转置于72 ℃的环境中，在DNA聚合酶的催化作用下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端一个接一个地连接上去，从而形成了两条新的子链。于是，一个DNA分子便复制成了两个。而新合成的DNA又可再度作为模板进行上述的循环，重复这三步操作，DNA片段便呈2的指数增长。该过程可在DNA扩增仪（PCR仪）内进行。 4．PCR技术的优点 快速、高效、灵活和易于操作是PCR技术的突出优点。 5．PCR扩增效果的检测 可用分光光度法进行检测。DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处测PCR产物稀释液的光吸收值（用A260 nm表示）。据测定，1 μg·mL－1的DNA在厚度为1 cm比色杯中的吸光值为0.02。以此为标准，可以计算出样品中的DNA浓度。公式如下： DNA的浓度（μg·mL－1）＝×稀释倍数思考：2003年SARS病毒席卷我国，随后生物科学研究所迅速研制出了SARS病毒基因诊断盒，使得能够快速诊断出非典患者，那么SARS病毒基因诊断盒所需的大量SARS基因是怎样获得的呢？提示：采用PCR技术对SARS的基因迅速扩增产生的。 1．PCR技术与DNA的复制 PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（230）。 2．你了解生物体内DNA的复制与PCR反应的异同吗？ 体内复制 PCR反应 解旋 在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开 加热至95 ℃，双链全部解开，不需解旋酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃ 特点 边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增 Taq DNA聚合酶 不需要 需要 循环次数 受生物体自身控制 30多次 产物 完整DNA DNA片段 相同点 都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行 3．PCR扩增产物是什么？ 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限制在两个引物链5′端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3′端开始延伸，其5′端是固定的，3′端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5′端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3′端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内，形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯的DNA片段供分析与检测用。 细胞内RNA和蛋白质的合成是从头开始的。 4．PCR的常见问题 PCR实验很容易出现假阳性（检测非目的片段的