0901班杨科勉精氨酸激酶表达及纯化模板(1).docVIP

综合实验：精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化PAGE 精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 报告题目精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名王小珍班级学号0802/2008114010223指导教师汪劲松完成时间2011年7月生物学实验教学中心目 录 TOC \o 1-3 \u 引言 PAGEREF _Toc303324303 \h 21 实验材料、试剂、仪器 PAGEREF _Toc303324304 \h 42 实验方法 PAGEREF _Toc303324305 \h 52.1配制LB液体培养基 PAGEREF _Toc303324306 \h 52.2 活化菌种 PAGEREF _Toc303324307 \h 52.3 扩大培养 PAGEREF _Toc303324308 \h 52.4 IPTG诱导AK的表达 PAGEREF _Toc303324309 \h 62.5蛋白质提取 PAGEREF _Toc303324310 \h 62.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 PAGEREF _Toc303324311 \h 62.7SDS电泳鉴定纯化程度 PAGEREF _Toc303324312 \h 73 结果与分析 PAGEREF _Toc303324313 \h 83.1层析谱图 PAGEREF _Toc303324314 \h 83.2 SDS电泳带型分析 PAGEREF _Toc303324315 \h 9总结 PAGEREF _Toc303324316 \h 10参考文献 PAGEREF _Toc303324317 \h 11致谢 PAGEREF _Toc303324318 \h 12PAGE 1PAGE 1精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 王小珍（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院 生物科学0802班 湖北 黄石 435002）摘 要：目的：研究精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化。方法：用含卡那霉素的LB液体培养基活化并扩大培养菌种，利用IPTG诱导精氨酸激酶（AK）的表达，经离心、超声波破壁获得AK粗提液。粗提液用His-tag Ni 亲和层析纯化，用SDS电泳鉴定纯化结果。结果：层析谱图典型，SDS电泳带型清晰，实验已分离得到了一定含量的AK，而且纯化程度较好关键词：精氨酸激酶（AK） 表达 亲和层析纯化 电泳鉴定综合实验：精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化PAGE 11精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 王小珍（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院 生物科学0802班 湖北 黄石 435002）引言 精氨酸激酶无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase, AK）（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatine kinase ，CK）（ATP:N-肌酸磷酸转移酶E.C.）， 是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用 。AK在体内催化反应方程式如下：Mg2++ADP+Arginine phosphate ←→ Mg2++ATP+Arginine某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK是由一个小的α螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行β折叠被7个α螺旋所包绕。过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部。如图所示：亲和层析法 亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。His-tag所用层析凝胶的基质上连接了一个氨基三乙酸，可以与Ni离子结合，而Ni离子与融合蛋白的6Xhis之间产生吸引力，从而将带有组氨酸标签的融合蛋白与其他蛋白区分开来。加样后，用平衡液可以将杂蛋白洗脱下来，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可回收靶蛋白。电泳电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的。一般凝胶介质中的pH维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样他们可以向阳极迁移。本实验我们做了以下工作：用含卡那霉素的LB液体培养基活化并扩大培养菌种，利用IPTG诱导精氨酸激酶（AK）的表达，经离心、超声波破壁获得AK粗提液。粗提液用His