基因工程-2-载体概论.pptVIP

2.M13载体的构建 五、噬菌体展示载体 其基本原理是将外源DNA片段插入噬菌体编码蛋白基因PⅢ中，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。 质粒 λ噬菌体 柯斯质粒 单链噬菌体 克隆DNA大片段 ±* + + - 构建基因组文库 - + + - 构建DNA文库 + - - - 常规的亚克隆化 + - - - 构建新型的DNA结构 + - - - 序列分析 + - - + 单链探针 - - - + 外源基因在大肠杆菌中的表达 + - - - * 外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低　　　　　　　　　 四种常用载体的比较 * * * * * * * * * * * * * * * * * ①插入E.coli Lac片段(内含LacZ’) (LacZ基因前146个Aa的顺序-α-多肽) 可与感染的部分缺失LacZ基因的E.coli突变株进行α-互补,便于筛选②插入小片段DNA—多克隆位点(MCS). 质粒载体 载体 噬菌体载体 动物病毒载体 大肠杆菌质粒载体pBR322 单链DNA M13载体 SV40载体 乳头瘤病毒载体 昆虫杆状病毒载体 柯斯(COS)载体 λ噬菌体载体 枯草杆菌质粒载体pNC3 酵母菌质粒载体2μ 农杆菌Ti质粒载体Ti 一 基因工程的基本元件 ------载体 四、E.coli质粒载体 1.pBR322是基因工程中最重要的一个人工质粒,有万能质粒之美称. ①pBR322的构建 复制子:松弛型 选择标记:Amp、Tet 筛选形式:抗性插入失活 单一切点:24个 ③物理图谱 ②pBR322的特性 pBR322 plasmid F. Bolivar R. L. Rodriguez Bacterial Resistance pBR322酶切图谱 2.pUC系统 美国加利福尼亚大学的科学家J. Messing和J. Vieria于1987年首先构建 来自pBR322质粒的复制起点 氨苄青霉素的抗性基因 大肠杆菌β-半乳糖酶基因的启动子及其编码的α-肽链基因（lacZ’） 位于lacZ’基因内的一段MCS区段 2.pUC系统 X-gal 溴氯吲哚+ β-半乳糖苷 -----蓝白斑筛选 插入片段 无酶活性 白斑 未插入片段 有酶活性 蓝斑 β-半乳糖苷酶 3. TA载体 经 Taq DNA 聚合酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单个 A 酵母菌质粒载体 食品级微生物 适合于真核基因表达 基因产物外分泌 七、酵母菌质粒载体 多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为2μ质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（ARS片段）。 整合型、复制型、附加型和稳定型等类型。 ①含有E.coli质粒的复制起始序列。 ②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。 2.酵母菌质粒载体的特点 1.酵母菌质粒载体的类型 Type Name Description bacterial origin ColE1 ColE1 (pUC-type) origin of replication promoter Gal1-10 promoter Gal1-10 yeast promoter selectable marker ampR ampicillin resistance gene selectable marker chlR chloramphenicol resistance gene LOST in recombined (with insert) form selectable marker URA3 URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromere CEN4 yeast centromeric sequence yeast origin ARS1 ARS1 yeast origin of replication ④酵母菌稳定型质粒载体 着丝粒 第二节 噬菌体载体 一、 λ噬菌体载体 1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端  λ噬菌体线性DNA分子的粘性末端及其环化作用 （a）具有互补单链末端（粘性末端）的λ DNA分子。 （b）当进入宿主细胞后，通过粘性末端之间的碱基配对作用实现的线性分子的环化作用，由此形成的双链区叫做cos位点 GGGCGGCGACCT CCCGCCGCTGG