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蛋白质研究技术 一、蛋白质的理化性质 蛋白质的胶体性质 蛋白质的两性电离 蛋白质胶体性质与蛋白质沉淀 (五) 层 析 原理：溶质在互不相溶的两相之间分配行为存在差 别，从而导致移动速度的不同 ? 离子交换色谱 (ion exchange chromatography) ? 疏水作用色谱 (hydrophobic chromatography) ? 凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography) ? 亲和色谱 (affinity chromatography) ? 金属螯和色谱 (metal chelating chromatography) 离子交换色谱 原理：根据离子交换树脂对各种离子的亲和力不同 而达到分离的目的，大分子因与树脂亲和力 不同，以不同牢度被吸附于离子交换剂，通 过改变离子强度或(和)pH使大分子从树脂上 先后被洗脱 ? 分为：阴离子交换基：DEAE（二乙胺乙基） QAE（季铵乙基） 阳离子交换基： CM（羧甲基） P（磷酸基） SP（磺丙基） 实验条件的选择 实验条件的选择 疏水作用色谱 原理：根据蛋白质与吸附剂之间的弱疏水性 作用的差别进行蛋白质的分步洗脱 各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂 常用的疏水性配基： 苯基、短链烷基C3~C8）、 烷氨基、聚乙二醇和聚醚 疏水吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，过小则疏水性吸附作用不足，过大则洗脱困难 疏水作用色谱 疏水作用色谱的洗脱一般采用降低缓冲液中的盐浓度来 洗脱蛋白 也可以采用加入少量的有机溶剂来洗脱，如反相色谱 凝胶过滤色谱 概念： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据 它们分子大小不同而进行分离的技术，又可称作排 阻色谱或者分子筛色谱 原理： 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物 流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶 孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被 洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入 凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较 慢，最后被洗脱出来 常用凝胶：交联葡聚糖凝胶（Sephadex) 、聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂糖凝胶（ Sepharose） 凝胶过滤色谱的洗脱 凝胶过滤色谱的应用 生物大分子的分离纯化 分子量的测定 分级分离 溶液浓缩 平衡常数的测定 细胞及颗粒的分离 亲和色谱 原理：利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异 结合的化合物（称配体）连接到固相载体 上，当待提纯的生物大分子通过此层析柱 时，可以与载体上的配体特异的结合而留在 柱上，其他物质则不能结合，然后用适当方 法使生物大分子从配体上洗脱下来，从而达 到分离提纯的目的 特点：纯化效率高，提纯度可达几千倍 亲和色谱的应用 抗原和抗体 激素和受体蛋白 凝集素和多糖(糖蛋白) 酶与辅酶(或产物、抑制剂) 核酸与互补链（或核酸多聚酶、结合蛋白） 细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素） 金属螯合色谱 原理：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配 基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固 定相上，二价金属离子可以与流动相中含有 的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生 特异螯合作用而进行分离 蛋白质分离、纯化和鉴定 特点： 体系复杂: 含量低、组分多、干扰大 水溶液体系： 接近生理状态，尽量避免 使用有机溶剂 低温操作： 防止蛋白变性和失活 必要的添加剂： 蛋白酶抑制剂、还原剂 专业的仪器设备：制备型 蛋白质分离、纯化和鉴定 蛋白质分离提纯的原则： 纯度、活性和产量 蛋白质分离提纯的一般步骤： 破