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研究课题： 连云港海域养殖条斑紫菜丝状体黄斑病病原体的分离及鉴定 导师：王洪斌 副教授 生工052 夏亚明 答辩提纲： 研究背景知识 研究内容及意义 实验材料 实验方法与结果 结论 问题与展望 研究背景知识 08年夏天连云港海域紫菜养殖场在丝状体培育期大面积出现黄斑病，大量紫菜最后烂死，导致严重经济损失。 条斑紫菜(Porphyrayezoensis) 是我国主要紫菜栽培种，每年创造几十亿美元的产值，随着条斑紫菜栽培规模的不断扩大在其栽培过程中经常会遇到病害、发育调节等各种问题，其病害问题表现得越来越突出。多年来的大量研究表明，紫菜的病烂由多方面原因引起的，致病原因也非常复杂，其中微生物因素是不可忽视的重要原因之一。 研究内容及意义 以往人们多从紫菜本身寻找解决途径，忽略了在此过程中微生物的重要作用。 找出黄斑病的病原体并对其进行一定研究，从而对该病进行防治，减少经济的损失。 实验材料 1、样品 紫菜贝壳样本取自于连云港海域紫菜养殖场（由李信书博士惠赠），海水取自于连云港连岛海域。 2、培养基 2216E培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，陈海水1000ml，5M氢氧化钠溶液调pH值7.6～7.8。固体培养基另加2%的琼脂粉。 实验方法与结果 1、病原菌分离 2、人工回复感染 将分离出来的菌株分别命名为HYWX-1、HYWX-2。取2号菌在2216E液体培养基过夜培养，血球计数板测定菌体浓度为7.665×108个/ml。挑选健康的紫菜贝壳样本放入俩个玻璃缸中培养（海水500ml），标记为2号，每天向其中加入12ml菌液（2×108个/ml）,同时以不加有菌体的空白样本为对照，观察感染现象。 3、菌株形态 在光学显微镜下观察菌体形态，进行革兰氏染色，并用测微尺测量菌体大小。 菌体大小为 HYWX-1： 1.7-2μm×0.8-1.2μm； HYWX-2： 2.2-2.7μm×0.7-1.3μm。 4、菌株生长曲线的绘制 将菌株活化后分别以5%的接种量接种到2216E液体培养基，在各菌的最适生长条件下培养，从0h起，在1h取样,之后每隔2h取出于OD600下测定菌液浓度,至24h后每4h取样一次，持续40小时，以未接种菌株的培养基做空白。根据数据结果绘制生长曲线。 5、菌株的生理生化特征 按照微生物实验方法，进行各种生理生化反应。 HYWX-1能水解明胶，氧化酶阳性，接触酶阳性，ONPG反应阳性，H2S试验阳性，葡萄糖氧化发酵(O/F）试验为氧化型，VP试验阴性，不能产生吲哚，能利用甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，不利用乳糖、果糖、纤维二糖、麦芽糖。 HYWX-2能水解明胶，氧化酶为阳性，接触酶阳性，ONPG阳性，H2S试验阴性，能发酵葡萄糖，甲基红，VP阴性，能产生吲哚；能利用乳糖、纤维二糖、甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，而不能利用麦芽糖。 上表是HYWX-1、HYWX-2与已知的交替假单胞菌（查阅于其它文献资料）之间的生理生化性质的比较， 通过Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology分析比较，初步鉴定该俩个菌株属于Pseudoalteromonas sp.。 6、菌株的16SrRNA序列 根据《微生物学实验技术》，进行DNA基因组的抽提。将得到的DNA产物进行电泳。检测是否有DNA抽提出。以抽提出的DNA为模版进行PCR扩增，PCR反应体系（50μL体系）： ddH2O 36μL Buffer 5μL Mgcl2 4μL dNTP 1μL 上游引物 1μL 下游引物 1μL DNA模版 1μL Taq酶 1μL PCR扩增产物电泳图 GAGCCTGGATCTCCGTGGTAACGTCCTCCCGAGGGTTAGACTATCTACTTCTGGAGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATT