核酸扩增技术ppt课件.ppt

定量PCR中扩增产物的检测方法 凝胶电泳： PCR-ELISA 荧光PCR法 由于荧光PCR可使用现代化仪器对PCR产物实行实时检测，很容易保证扩增在指数增长期内进行，是定量PCR扩增产物检测的一个发展方向。 第二节 荧光定量聚合酶链反应（Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR） 一、荧光定量PCR技术基本原理 二、荧光定量PCR技术 三、荧光定量PCR测定的数据处理 四、实时荧光定量 PCR技术的应用 荧光定量PCR技术基本原理 荧光扩增曲线图 Ct值 标准定量曲线 扩增产物的检测及分析 凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP） 单链构型多态性分析法（PCR-SSCP） 核酸探针杂交法 PCR产物测序 琼脂糖凝胶电泳 制胶 加样 电泳 紫外光检测 特点： 分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开； 上样量远大于琼脂糖凝胶； 回收的DNA纯度高； 采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。 用途：PCR扩增指纹图、多重PCR。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)  据目的基因序列可查出所包含的酶切位点，用相应的限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物，然后进行电泳，观察消化片段的大小是否与序列资料相符。 用途： 传染病病原体基因分型 人类基因的变异性研究。 单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP） 将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。 核酸探针杂交法 ?点杂交 反向点杂交 微孔板杂交 荧光探针杂交法 点杂交（dot blot） 原理：将扩增产物变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的寡核苷酸探针与之杂交。 探针： 放射性同位素标记探针检测的敏感、特异，具有不稳定性和放射性危害。 非放射性物质（如生物素、地高辛、荧光素等）标记的探针稳定性高、使用安全、检测速度快 用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 反向点杂交(reverse dot blot) 原理：使用带有标记物的引物进行PCR扩增，然后将扩增产物变性。将不同的寡核酸探针固定在尼龙膜上，用变性的PCR产物与之杂交。 探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。 用途：反向点杂交特别适用于遗传性疾病多个位点的点突变分析。 结果分析： 正常纯合子 突变纯合子 杂合子 微孔板杂交( microplate hybridization) 夹心杂交 荧光探针杂交法 目前临床上常用荧光探针法来检测PCR产物，主要的方法有TaqMan技术、分子信标技术、复合探针法等。 PCR产物测序 对PCR产物进行测序是检测PCR产物特异性最可靠的方法，可将PCR产物克隆到载体上进行测序，也可对直接PCR产物进行测序。 常见问题原因分析及处理 假阳性 非特异性PCR产物 假阴性 引物二聚体 假阳性 PCR产物是最主要的污染源。 含有靶DNA序列的质粒的污染。 阳性对照的污染。 标本之间的交叉污染。 Taq聚合酶中带有细菌DNA，当PCR扩增片段为保守的rRNA序列时，易造成假阳性。 怎么可能全家人都得了性病 ??? 何某，女，46岁，某部队卫生所护士，离婚10年，与一男友交往5年。她近来忽然感到阴部瘙痒，白带有异味，想到自己有非婚性行为，怕万一得性病被人知道，便悄悄到郊区一个小诊所去看病。结果被告知是"淋病"，用了许多药，未见明显好转。她通过查书感到"问题严重”，担心全家都会传染，尤其是正读初中的女儿被传染上怎么办？为了孩子，顾不上面子了。她不仅带自己的女儿、70岁老母到医院检查，还动员最近与其同居一处的妹妹、妹夫及14岁的外甥女都到医院检查。医师给他们用最先进的"PCR”检测，结果6个人都是"淋球菌感染”！ 非特异性PCR产物 引物特异性不高，引物用量过多，应调换引物或降低引物用量。 Taq DNA聚合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或使用质量较好的酶。 Mg2+ 浓度过高，可适当调节Mg2+浓度。 退火温度过低，退火及延伸时间偏长，可提高退火温度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增。