考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含（Bradford法）课件.pptVIP

蛋白质含量的测定;一、实验目的掌握Brodford法测量蛋白质浓度的原理和操作技术。; 二、实验原理 ; 考马斯亮蓝G250有红蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。经研究证明，染料主要是蛋白质中碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基相结合。 反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜色的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，，因此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白的含量。;考马斯亮蓝染色法的优点： （1）灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），测其最低蛋白质测量可达1mg。 (2)测定快速,简洁。只需加入一种试剂，完成一个样品的测定，只需5min左右。 (3)此方法干扰物少 如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg+例子，Tris缓冲液、蔗糖、甘油、EDTA等均不干扰此法。 ; 考马斯亮蓝染色法的缺点： 1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差。在制作曲线时通常选用G-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 2.仍然有一些物质干扰此法的测定。主要干扰物质有：去污剂Triton X-100, SDS和 0.1mol/L的NaOH 3.标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定蛋白质的浓度 ;三、试剂和器材;2．器材;四、操作方法1、标准曲线的制作;管号;另取3支清洁试管，编号8、9、10，用微量进样器按下表操作，将待测蛋白配成系列浓度。;管号;各试管充分混匀后，用取样器分别加入5.0mL考马斯亮蓝G250试剂，每加完一管，立即混合。;各管室温静置2-5min后，在分光光度计上测定595nm处的光吸收值A595，空白对照为1号试管，标准和待测蛋白同时比色。 注意：不可使用石英比色皿，只能用玻璃比色皿，使用后立即用少量95%乙醇润洗，洗去颜色。;以标准蛋白质浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度A595为纵坐标作图，得到一条标准曲线。;在标准曲线上，根据测出的待测样品的A595值，查处试管中蛋白质浓度，再按照计算公式： 待测蛋白质的浓度（mg/mL）=查出的浓度×稀释倍数 计算出待测蛋白浓度???如样品稀释合理且操作得当，待测蛋白的三个数值应具有同一性，取其平均值作为待测蛋白浓度，如某一吸收值落在标准曲线线性范围外，舍弃该点。;五.计算 六.注意事项 1. 蛋白质反应液应该储存在棕色瓶内，可长期使用，但如果变为绿色，则需要重配 2.比色皿只能用自来水冲洗，蒸馏水、95%乙醇润洗，不可用试管刷或者其他物品直接洗刷。 3.玻璃比色皿1套只有4只，可以同时使用，严禁与其他比色皿混用。 4.分光光度计的吸光值在0.2-0.7时准确度最高，低于0.1而超出0.1时误差较大，如未知样品的读数不在此范围内，应将样品做适当稀释或浓缩。;七.补充 蛋白质含量测定方法比较 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。;值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 ;思考题 1.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是什么？ 2.为什么不能用试管刷来清洗比色皿？ 3.能否将卫生纸塞入比色皿中吸干余液？ ;