尿激酶原研究概况.pptVIP

尿激酶原的研究概况 军事医学科学院生物工程研究所 张正光 二、尿激酶原的研究历史 1973 年Bernik从组织培养液中发现尿激酶原。 1970 年代末到1980年代初人们先后从新鲜人 尿、人和动物的正常细胞、肿瘤细胞中 纯化出单链尿激酶并命名为尿激酶原。 1980 年代中期开始，欧美日等发达国家用基 因重组技术克隆表达尿激酶原的工程菌 或工程细胞株纯化制备尿激酶原。 三、国内研究概况 〝七五〞期间，北京大学、南京大学和军事医学科学院生物工程研究所开始研究重组人尿激酶原，都得到国家科技部〝 863 〞委员会的资助。我所率先获得全长人尿酶原基因cDNA克隆，接着又构建出高产工程细胞株。并于〝八五〞中期和〝九五〞期间完成了重组尿激酶原的中试工艺研究和临床前安全评价，于2001年完成Ⅰ期临床试验。 五、pro-UK的化学结构 pro-UK由411个氨基酸残基组成的单链多肽（简称pro-UK），分子量约为49KD左右，在302位天冬酰胺残基有一个糖链，分子量约2320Da，由岩藻糖、甘露糖、半乳糖和N-乙酰-葡萄糖胺组成，在第18位苏氨酸残基上有一个糖基?岩藻糖，分子量180Da。其一级结构如下图所示： 尿激酶原的结构 Pro-UK属于丝氨酸蛋白酶类，分子内有12对二硫键。pro-UK分子按结构功能可分为四个结构域，依次为：（1）表皮生长因子结构域(第5-49位氨基酸残基），与表皮生长因子高度同源，其功能与促进pro-UK的生物合成有关，该区有三对二硫键，即在11与19、13与31、33与42氨基酸残基之间各有一对二硫键；（2）Kringle（指环）结构域（第50-136位氨基酸残基），其功能与血小板蛋白和细胞膜蛋白结合有关，该区也有三对二硫键，即 50 与130、71与113、102与126氨基酸残基之间各有一对二硫键； （3）丝氨酸蛋白酶结构域(144-411位氨基酸残基),位于其羧基端的His204、Asp255与Ser356 三个氨基酸残基构成该酶的活性中心，Asn302 为糖化位点, 该区共有5对二硫键，即在 148-279、189-205、197 -268、293-258和368-380氨基酸残基之间各有一对二硫键；（4）连接区(第136-143位氨基酸残基)。 六、pro-UK的理化性质 pro-UK分子有四个酶切位点： （1）第一个酶切位点在158位赖氨酸与159位异亮氨酸之间，纤溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶和半胱氨酸内肽酶及因子Ⅻ?可水解该酶切位点之间的肽键。该位点被切开后，148位与279位的二硫键将A链和B链相连接，A链C末端的赖氨酸自动脱落，pro-UK即变成具有高度催化活性的双链尿激酶(UK)； （2） 第二个酶切位点在135和136两个赖氨酸之间，高分子双链UK可被纤溶酶继续水解该酶切位点，并脱去N-末端的第 136位赖氨酸，变成低分子双链UK，分子量为33KD，其活性与高分子UK相同；（3）第三个酶切位点在 143 位谷氨酸与144 位亮氨酸之间，蛋白酶可裂解该肽键产生分子量为32KD的单链低分子尿激酶原(pro-UK)，其溶血栓活性生花特性与高分子pro-UK相似； （4）第四个酶切位点在156位的精氨酸与157位的苯丙氨酸之间，凝血酶可水解该位点的肽键，生成双链pro-UK，由148位与279位的二硫键将A、B两条链相连接起来，其活性只有双链UK的1/500，但其催化活性与生化特性与单链pro-UK相似。纤溶酶可水解B链N-端第157和158两个氨基酸，生成双链UK。pro-UK在溶液中不稳定，容易逐渐水解成小分子尿激酶原或变成双链尿激酶，但其冻干品在4℃以下是稳定的。 七、尿激酶原的血栓溶解特异性 1、pro-UK本身活性很低，在血浆中只有微弱的活性，对体内纤溶系统影响很小，当给药剂量太大时（超过1mg/kg），部分水解成双链UK，则对体内纤溶系统有影响。pro-UK到达血栓表面，被那里的纤溶酶激活，部分变成双链UK，后者激活结合在血栓表面构型有所改变的纤溶酶原变成纤溶酶，使血栓纤维蛋白部分溶解。 2、当血栓纤维蛋白暴露出E-片段，单链pro-UK能直接激活结合在该片段C-端两个赖氨酸残基上的纤溶酶原，其活性增加500倍，产生大量纤溶酶，使血栓纤维蛋白迅速溶解，因此pro-UK是特异性的纤溶酶原激活剂。单链pro-UK被纤溶酶、嗜热杆菌金属蛋白酶完全激活后，其比活性与尿激酶相同（1-1.2?105 IU/mg，天然尿激酶或尿激酶原的比活性的国际标准为104,000IU/mg）。 尿激酶原作用机理示意图