控制水稻不定根原基变成的关键基因arli的表达及激素调控.docVIP

控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控 第三部分在不定根原基起始分化初期,参与原基起始细胞分裂及 细胞分裂周期的标记基因表达的LMc半定量分析 1.材料与方法 1.1材料 水稻:粳稻中花一11,arll突变体 1.2方法 1.2.1材料准备: 水稻种子,放于培养皿中,37OC黑暗下浸种至露白(24h),然后转移至湿润滤 纸上30/c培养d1:将发芽的种子移至装有自来水(pH5.0)的塑料槽尼龙纱网上,生 长条件同本章第一部分生长3d取稻根茎结合部0.5一1.Ocm,固定 1.2.2LeM(Laser一eaptureMierodisseetion)分析 4天苗龄的水稻根茎结合部0.5一,.Ocm:在EAA溶液(酒精;冰醋酸二:31)中4e固 定过夜然后由低浓度到高浓度的乙醇(50%!70%!85%!95%!和100%)逐级脱 水!二甲苯透明!浸蜡(用52e低熔点石蜡,sigma一Aldrihc,Gemrna)和包埋T(kagai 等.,2004;Shibutnai等.,2000)样品切成7pm厚,置于HistoGeneLCMslide(Areturus, CA,USA)上,用DEPc水37e展片,烘干的切片用二甲苯脱蜡后(分2次,每次10分 钟),立即用Pix一eell11LCMsystemA(crturus,MountainView,CA,USA)进行激光捕获 (Kekr等,.2003,Nkaazono等.2003)用PieopureRNAisolationkit(Aiuturus,CA,USA) 从捕获到的细胞中提取胭A再用Ribogreenreagent(Moleeularprobes,Eugene,OR, USA)分别测定从野生型植株中柱鞘的不定根原基发生区域和非发生区域及arlj突变体 相应的区域组织5000个细胞中提取的总RNA浓度参照几boAmpKit操作说明 (1tl切://www.areturus.eom),每个样品取98.2ng总RNA用形boAmpKit进行逆转录和第 一轮扩增PeR反应条件:94oe,4min;[94oC,45see,61oC:45see,72oC:l Sec8x30循环相关基因的引物序列: O3.SRC(508bP):UPS.ACCGGGCAGAACTCGAATGGCAATCC3. Lows.CGGAGTCGGTGAACGCGGACAACCTC3. QHB(900bP):Ups.ATCCCGGAAGAGACCAAATCAGA3. Lows.TAGGACTAGGCACAGCGACAAGAG3. 图3.月几1基因启动子::GUS融合转基因分析 Figuer3.ALRIPormoet-rdrivenGUSexPerssioninvaroustissues.FormAtoJ:lemmatiPs(A),lemma vein(B),PdeieelofyoungPnaicle(C),aurical(D),baseofleafbldae(E),vaseularyclindertissueofPrimyar orotnad!aetarloorst(F),orottiP(G)nadvaseulartissueofnahter(H)rachisnadPrim脚acrhisbnarehes穗轴与一级枝梗连接处(I)minorveins(J,横向的小叶脉)FromKto,0cross一seetionsofdaventitious;oot Primodriaatfi邝tnode(K),seuetllum(L),younglatearlorot(M),vaseulareylinderofseminalorot困)nadlaetarlorotprimodriumof7d一oldseedlings(o)(K图B护Zooum,M和o中b护50um,N,b犷100 um) 控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控 2.2参与中柱鞘不定根原基起始细胞分裂的标记基因表达分析 图5汤四,以,5.c冲君反彭网万基因在不定根原基起始 细胞分裂阶段的表达分析(Wt一P=野生型原基部位, a厂11,二突变体类似原基部位.30cycles) Fi即re5.T一PCRanalysisfortheexpressions of嵘扮双免6艺万and免六月穷inperieyeleeells adjaeenttoPeriPheralvaseulareylinder inwildtype(WT)andarllmutantplants 图6.几个细胞分裂周期标记基因在不定根 原基启动初期的表达比较(DcNA来 源:Wt一=P野生型原基部位:Wt一Pn二野生型非 原基部位;arll一书交变体类似原基部 位.30eyeles)