技术及诱导多功能干细胞（iPS）在医学领域的发展应用.pptVIP

SIDANSAI Biotechnology;靶向基因修饰;基因敲除的方法;锌指核糖核酸酶（ZFN） DNA 识别域 (ZFP) + 非特异性核酸内切酶构成（FokI); TALE domain: DNA 识别域 TALE，植物病原体黄单胞菌 Xantomonas – 用于调控宿主基因 由34的氨基酸长度的重复单位构成 第12，13位点氨基酸（ repeat-variable di-residue，RVD）不同 RVD决定识别位点不同 Nuclease domain: DNA剪切域 FokI，发现于海床黄杆菌 Flavobacterium okeanokoites 采取其非特异性DNA剪切结构域 形成二聚体时发生剪切;TALEN切割双链;应用 II：基因敲入;应用 III: 点突变;TALEN广泛应用;构建TALEN质粒;TALEN的组装(Golden Gate);斯丹赛一步法 ;FastTALETM连接TALEN;多种TALEN骨架载体，满足不同物种需求;TALEN质粒构建流程;靶点设计;TALEN连接; 转化至感受态细胞 在Kana+ LB平板中培养;挑单克隆， 细菌培养;DNA质粒抽提，酶切鉴定;上游引物305: 5’-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3’ 下游引物306: 5’-AGCTGGGCCACGATTGAC-3’ S247引物： 5’- GGGAGCACCCCTCAACCTGAC-3’ ;测序结果比对;得到测序正确质粒;测序正确质粒;应用实例1 细胞建系;脂质体转染入Hela细胞中；puromycin药物筛选3天;大于53%（每100个细胞中有53个细胞发生碱基突变）;*;打靶效率经验参考;打靶效率经验参考;应用实例2 动物模型——斑马鱼;应用实例3 动物模型——小鼠;应用实例3 动物模型——小鼠;应用实例3 动物模型——小鼠; 斯丹赛部分成功案例; 斯丹赛部分成功案例; 斯丹赛部分成功案例; 斯丹赛部分成功案例;TALEN 服务和产品;专业、完善的技术保障; ? 培训地点：上海市浦东新区蔡伦路720弄301室 培训时间：9:30-19:00 培训内容： TALEN技术相关讲座：TALEN技术介绍、发展与应用 TALEN构建的实验室操作：根据设计好的TALEN序列 连接TALEN； TALEN技术疑难解答及讨论。 ;iPS细胞建系及临床应用;Shinya Yamanaka (山中伸弥) ;研究进展：干细胞是人体内可以转化为各种组织和器官的细胞，过去只能从胚胎中获得。 2006年日本京都大学山中伸弥领导的实验室在世界著名学术杂志《细胞》上首次报道了诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem cells，iPS）技术研究。 2007年末，Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。 2008年4月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成ips细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。 2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的ips细胞培育出血小板，而且从技术上说用ips细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的；紧接着，日本庆应大学科学家又宣布，成功用实验鼠的ips细胞培育出鼠角膜上皮细胞。 ;2009年3月伊始，ips细胞研究便相继迎来两项重大突破。英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为ips细胞的方法；美国科学家则在《细胞》杂志上宣布，他们可以将ips细胞中因转化需要而植入的有害基因移除，且保证神经元细胞的基本功能不受影响。 2009年7月，ips细胞研究在临床应用道路上又迈出非常重要的一步。据英国《自然》杂志网站23日报道，中国科学家周琪和高绍荣等人利用ips细胞克隆出活体实验鼠，首次证明ips细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。该成果让人们看到了ips细胞的实用性。 2010年7月，巴西圣保罗大学医疗系的科研人员最近通过改造??肤基因获取诱导多功能干细胞（iPS细胞）的科研成果。 ;Oct4 Sox2 Klf4 C-myc;人类iPS 产生流程;用于iPS建立的体细胞来源 ;iPSCs 临床应用;1.疾病模型建立;疾病模型—用于发病过程研究;疾病模型—用于疾病机理研究;高通量筛选方法：对疾病的特征蛋白进行免疫荧光分析;2.细胞替代疗法;ips细胞系定向分化：细胞替代疗法;iPS细胞系定点修复;定点修复后的ips细胞系经定向分化得到正常细胞！;iPS细胞系定点修复;iPS技术服务及相关培训;基因打