光谱分析法研究生课件.ppt

通过荧光量子产率公式的分析，我们知道，荧光分子所处的溶液环境对于荧光的发射有着直接的影响。因此适当地选取试验条件，将会有利于提高荧光分析的灵敏度和选择性。 当温度升高时，分子的热运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，使得无辐射的跃迁增加，从而降低了荧光效率。而当温度降低时，介质的黏度增大，溶剂分子与溶质分子间碰撞的机会减少了，降低了无辐射跃迁的几率，使得荧光增强。所以选择低温条件下进行荧光检测将有利于提高分析的灵敏度。一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。因此，对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。 溶剂对荧光光谱的影响主要是由于溶液的介电常数因素的作用。随着溶剂极性的增加，荧光物质π电子跃迁的几率增加，荧光强度也增强。还有一种情况是，溶剂和荧光物质形成氢键或使得荧光物质的电离状态发生改变，也将会影响到荧光的强度。一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大。 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。 对于含酸性或碱性基团的荧光物质，比如苯胺等，它以分子形式存在时能够产生蓝色荧光，但是当pH大于12或小于5的时候，它主要以阴阳离子的形式存在，这时均不能发射荧光。所以对于这一类物质， pH值也是影响它们荧光强度的因素之一。 另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。 * 常见的荧光光谱仪有两种：荧光光度计 * 我们常见的荧光光谱仪主要有两种，荧光光度计和荧光分光光度计。区别在于单色器色散元件的不同，前者的的两个单色器都用滤光片，后者采用棱镜和光栅为色散元件。 激发光源发出的光，透过单色器得到特定波长的激发光，使得样品激发，产生荧光。产生的荧光中垂直于激发光束部分通过发射单色器，通常只允许相应于最强荧光发射的波长通过，截至激发光和杂散光。通过的荧光有检测器感知并转化为电信号，进行记录或者显示。 汞灯：气体放电光源，离散线光谱，在254-734纳米范围产生一系列谱线。 当一束一定强度的紫外光照射在到样品池的时候，可以在溶液的各个方向观察荧光强度。但是由于激发光的一部分可以透过样品池，所以在投射光的方向观察荧光是不合适的，所以一般在与激发光垂直的方向测量荧光强度。 * 光源要求稳定和强度，可以直接影响仪器的精密度和灵敏度。常见的光源有氙灯和汞灯。常用氙灯，灯内装有氙气，通电后氙气电离，产生较强的连续光谱，分布在250-700纳米范围内，在300-400波段辐射线的强度几乎相等。 汞灯：气体放电，离散线光谱，在254-734纳米范围产生一系列谱线。 样品池需要用低荧光光源，常用石英池。形状以散射光较少的方形为宜。 检测器普遍使用光电倍增管，有比较高的灵敏度。 荧光光谱仪需要激发光和荧光两个单色器。激发单色器用于荧光激发光谱的扫描及选择激发波长，发射单色器用于扫描荧光发射光谱及分离荧光发射波长。 光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm) 氙灯：紫外、可见光区均可用作光源 * 荧光的强度往往比较弱，因此要求检测器有较高的灵敏度。在荧光分光光度计中常用光电倍增管。 在弱光下，光电倍增管的电流来源于光子碰撞光阴极产生的光电子发射，并经倍增后在阳极形成电脉冲输出。光电倍增管，其各电极之间均加有规定值较高的直流电压。当光子打到光阴极时，由于光电效应的作用，其表面可以产生能量微弱的游离电子，称为光电子；该电子在直流高压产生的电场作用下离开光阴极，同时被加速，再次打到打拿极上并产生出能量更大数量更多的光电子，就这样经过多个打拿极的反复放大，最后使阳极产生电脉冲信号  与紫外-可见光谱法相比较， 比紫外可见分光光度计法高2-3个数量级，检测限最低可达10-14M。与 紫外-可见分光光度法相比较，荧光是从入射光的直角方向检测，即在黑背景之下检测荧光的发射。所以… 选择性好，确定合适的激发光波长和荧光波长，能够达到很高的选择性，有利于分析复杂的多组分混合物。 荧光分析法能提供包括激光光谱和发射光谱以及荧光强度、荧光效率荧光寿命等许多物理参数，这些参数反映了分子的各种特性，能从不同角度提供被研究的分子的信息。 * ?f 等于发射光量子数和吸收光量子数的比值。荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光 量子效率?f 。当一束单色光透过溶液后，由于溶液吸收了部分的光能