氯化镧通过nf-κb通路调控rankl诱导破骨细胞分化成熟的体外实验研究-lanthanum chloride regulates rankl - induced differentiation and maturation of osteoclasts through nf - κ b pathway in vitro.docxVIP

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2018-07-27 发布于上海
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氯化镧通过nf-κb通路调控rankl诱导破骨细胞分化成熟的体外实验研究-lanthanum chloride regulates rankl - induced differentiation and maturation of osteoclasts through nf - κ b pathway in vitro.docx

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氯化镧通过nf-κb通路调控rankl诱导破骨细胞分化成熟的体外实验研究-lanthanum chloride regulates rankl - induced differentiation and maturation of osteoclasts through nf - κ b pathway in vitro

摘要目的：通过体外实验观察一定浓度氯化镧对RANKL诱导的破骨细胞分化成熟的影响及对破骨细胞分化成熟主要相关信号通路因子在蛋白及磷酸化水平表达的作用，为进一步研究镧元素对于破骨细胞分化成熟的影响以及未来对镧元素更多的基础研究提供理论参考。方法：体外提取小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BoneMarrow-derivedMacrophage,BMM），并使用核因子κB受体活化配体（ReceptorActivitorofNuclearFactor-kappaBLigand，RANKL）及巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage-ColonyStimulatingFactor，M-CSF）体外诱导培养其分化为成熟的破骨细胞。使用CCK-8检测加入不同浓度氯化镧对细胞活性的影响并选取合适的实验浓度进行后续相关实验。按研究目的并结合CCK-8结果将细胞随机分为五组：空白对照组（A组）、阳性对照组（B组）、50μmol/L低浓度氯化镧组（C组）、100μmol/L中浓度氯化镧组（D组）、200μmol/L高浓度氯化镧组（E组）。采用TRAP（TartrateResistantAcidPhosphatase）染色检测各组成熟破骨细胞的数量及细胞TRAP阳性染色面积。WesternBlot检测氯化镧的加入对破骨细胞分化成熟重要通路NF-κB信号通路相关因子（p65及IκBα等）在蛋白及磷酸化水平及对破骨细胞重要转录因子活化T细胞核因子1蛋白（NFATc1）表达的影响。结果：CCK-8检测在24、48、72、96小时时间点，800μM及以下浓度的氯化镧对BMM细胞的生存未见明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05），但当浓度超过800μM时，可见相对明显的细胞毒作用和生长抑制作用（P＜0.05）。TRAP染色发现，空白对照组未见破骨细胞生成，而B、C、D、E组均有成熟破骨细胞生成，差异有统计学意义（P＜0.05）。C、D、E组在加入不同浓度氯化镧后相较B组只加RANKL诱导的破骨细胞分化成熟均受到不同程度的抑制，差异有统计学意义（P＜0.05），且加入不同浓度氯化镧的C、D、E组各组间差异有统计学意义（P＜0.05）。WesternBlot检测结果发现，氯化镧可抑制NF-κB通路的激活,并在长期过程中减少破骨细胞重要转录因子蛋白NFATc1的表达。结论：本实验中适当浓度范围的氯化镧对细胞未见明显细胞毒作用；氯化II镧可在一定程度上抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化成熟，减少活化T细胞核因子1蛋白（NFATc1）的表达，且作用在一定范围内与剂量成一定的量效关系。其机制可能与氯化镧能够抑制破骨细胞NF-κB通路相关因子的激活作用有关。关键词：氯化镧；破骨细胞；NF-κB；BMM；RANKLIIIABSTRACTObjective:UsingexperimentinvitrotoinvestigatetheeffectofacertainconcentrationoflanthanumchlorideonRANKL-induceddifferentiationandtheexpressionsofosteoclastogensisrelatedtosignalfactorsinthelevelofproteinandphosphorylation.Togivingtheoreticbasisandexperimentalreferenceabouteffectoflanthanumonosteoclastogensisandthefurtherusingoflanthanumelementsinthefuture.Methods:ExtracttheBoneMarrow-derivedMacrophage(BMM)invitro,afterwardsusingReceptorActivitorofNuclearFactor-kappaBLigand(RANKL)andMacrophage-ColonyStimulatingFactor(M-CSF)toinducethedifferentiationofitinvitro.TestthecytotoxicityofdifferentconcentrationsoflanthanumchloridebyusingCellCountingKit-8andafterthatchoosingtheappropriateconcentrationusedinourfollowingexperiments.Devidingcellsrandomlyinto5groupsaccordingtoourdesignandtheresultofCCK-8:Blankcontrolgourp(gourpA)、Positiveco