棉花acds标签突变体库构建-construction of cotton acds label mutant library.docxVIP

摘要棉花是一种重要的经济作物，近年来遭受干旱、虫灾等灾害影响较大，急需培育新的品种来抵抗这些生物和非生物胁迫。目前棉花育种主要采用传统的杂交育种手段，这种方法受到周期长、性状不易发现等因素影响，很难快速的培育出新品种。植物基因工程技术在棉花育种上得到成功的应用。然而，目的基因的克隆是制约棉花生物技术育种的主要因素。突变体为研究基因功能和克隆基因提供了很大的便利，这就要求我们建立棉花突变体库，进而筛选相关突变体，培育棉花新品种。棉花遗传转化方法的建立也为运用生物学方法建立突变体库提供可能。转座子标签法是克隆新基因的一种有效方法，它利用转座因子插入高等植物基因组中造成基因失活，通过分析转座因子插入位点的旁邻序列，进而克隆该基因。利用Ac/Ds标签系统构建插入突变体库是较为理想的方法。将玉米中发现的Ac/Ds转座元件构建成双元载体系统，利用已成熟的棉花转基因技术（农杆菌介导法，基因枪轰击法和花粉管通道法），将该系统转到棉花基因组中，构建棉花的Ac/Ds标签突变体库。通过试验，优化了棉花农杆菌介导法转化程序。以生长一周的棉花无菌苗的下胚轴为外植体，MSB5添加0.1mg/L的IAA、KT和2,4-D为诱导培养基，能较好的诱导出愈伤组织。3-4周继代一次，继代培养基保持IAA浓度为0.1mg/L不变，KT和2,4-D的浓度均比前一次继代培养的浓度降低0.01mg/L。通过3-4次继代，可获得胚性愈伤。已经获得品种Coker413的胚性愈伤，正在诱导分化成苗。运用花粉管注射法获得了转Ac/Ds转座元件的转基因棉花。通过质粒浓度梯度和质粒种类对坐桃率的影响因素试验，表明最佳质粒注射浓度为0.02μg/μL，而质粒种类对坐桃率没有影响。已经获得了36父本的转基因植株。14株转化Ac转座酶植株和3株转化Ds转座元件植株，可用做杂交，建突变体库。本研究将玉米Ac/Ds转座元件构建的双元载体分别导入陆地棉36父本等品种中，利用Ds的可控转座，构建陆地棉Ac/Ds标签插入突变体库，为棉花基因的克隆和功能研究奠定基础。关键词：棉花，Ac/Ds标签系统，转座子，突变体IABSTRACTCottonisanimportanteconomiccrop,butatrecentyearstheproductionofcottonwaseffcctedbydroughtandinsects,wasbadlyinneedofnewbreedings.Now,themainmethodofcottonbreedingistraditionalcrossbreeding.However,becauseofitslongperiodandcharacterscannoteasilydiscovered,itcannotobtainnewbreedingsrapidly.Nowtheplantgeneticengineeringwassuccessfulusedinthecottonbreeding.Butthecloningofaimedgeneisthemainlimitedfactorinbiotechnologybreeding.Mutantingenecloningandrevealinggenefunctionisnecessary,soweshouldconstructcottonmutantlibrary.Inthecottonmutantlibrary,wecanselecttheusefulcottonmutants,usethemutantswecanbreednewcottonbreedings.Theconstructionofcottontransgenosisissuppliedthepossibilitytoconstructthemutantlibraryinusingbiochemicalapproach.Transposontaggingisastrategyemployedtogenerateinsertionalmutationinhigherplants,bywhichthemutantedgenescanbeeasilyidentifiedbyisolatingtheDNAflankingsequencesoftheinsertedtransposon.UtilizingAc/Ds(Activator/Dissociation)taggingsystemisastrategymethodtoconstructcottoninsertionalmutagenesislibrary.Usingtransposableelementsystemwhichwasfirstdiscoveredinmaizetoconstructthebi