重组克隆筛选.pptVIP

重组克隆的筛选* 1、抗性筛选； 2、蓝白斑筛选； 3、酶切电泳筛选(*)； 4、PCR筛选； 5、测序验证； 6、表达筛选； 7、生物活性筛选。 抗性筛选--质粒载体携带的筛选标记 1. AmpR （氨苄青霉素抗性） 2、TetR (四环素抗性） 3、KanR (卡那霉素抗性) 特点： 一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入。 克隆的Amp抗性筛选 蓝白斑筛选－－β半乳糖苷酶（Lac Z)的显色反应 一、α互补：LacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。（需要IPTG诱导表达）－－蓝斑； 二、外源基因插入载体后，使载体部分LacZ失活，无法进行α互补－－白斑。（√） 三、特点： 1、未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选； 2、无法确定基因插入的方向； 3、特殊：基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分LacZ失活，将产生α互补，产生蓝斑。 酶切电泳筛选(*) 一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片断的大小。 二、特点： 1、可鉴定外源基因的重组和插入方向。 2、结果可靠但操作比较麻烦； 3、无法检测基因内部的突变。 EcoR1和Xho1双酶切筛选 PCR筛选 1、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒。 二、特点： 1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。 测序验证 一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。 1、一次测序反应一般准确测定500bp左右(也有测准800bp,价格贵）－－60元左右。 2、测定的序列靠近引物（起点）20~30bp不准，500bp后的序列也不准。 3、（1）质粒测序： 测序引物公司提供 （2）PCR产物直接测序： 测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。 注意: A. 测序引物必须与模板完全配对；含有mix碱基的引物一般不能测序； B. 测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在50％～60%左右。 一. 测序图谱分析,判断测序结果可靠性 二. 测序序列的分析 注意: 有时序列是反测的,需要先把序列反转后再同源联配.(用Vector NTI) 表达筛选 一、SDS筛选； 二、亲和筛选； 三、免疫筛选； SDS筛选 1、小量诱导表达； 2、全菌液裂解后进行SDS电泳； 3、重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。（需加不诱导的对照） 特点： 1、可检测外源基因的表达。（一般基因的插入，方向，读框都正确） 2、无法筛选不能有效表达的重组质粒。 亲和筛选 1. 50 ml菌液诱导表达， 2、超声破菌， 3、用少量亲和beads吸附上清； 4、SDS检测，在特点位点将出现一条蛋白带。 特点： 1、适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测； 2、比SDS筛选更灵敏（富集），可靠； 3、比较麻烦。 免疫筛选 用抗体检测目标蛋白： Western blot（最准确） ELISA (可能会受到交叉反应的干扰） 生物活性筛选 酶：测定酶活； 亲和蛋白：与亲和底物作用。 其它的生物活性。 分子克隆流程 1、分析基因，载体特点； 2、设计克隆策略； 3、检测基因，载体的正确性； 4、制备感受态细胞，目的基因，载体； 5、连接，转化。 6、筛选克隆 （1）Amp抗性初筛； （2）PCR筛选（或酶切筛选）； （3）表达筛选（SDS和亲和筛选）； （4）测序验证 （5）生物活性筛选。