瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)发酵条件的优化及s层蛋白的提取和应用-optimization of fermentation conditions of lactobacillus helveticus and extraction and application of s - layer protein.docxVIP

瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus）发酵条件的优化及S层蛋白的提取和应用摘要S层蛋白是古菌和一些细菌细胞表面的一类蛋白质分子。S层蛋白有一种蛋白或糖蛋白形成晶格结构，罕见两种或以上的蛋白。S层蛋白与细胞外被通过非共价键结合，利用高浓度的氢键破坏试剂如脲素、氯化锂、盐酸胍等可将S层蛋白从细胞外被上解离下来，得到S层蛋白的亚单位。S层蛋白序列中非极性氨基酸含量比较高，赋予了S层蛋白的较高的疏水性，使得S层蛋白在除去变性剂后，能在溶液、气液界面、固体支持物或脂膜等界面上重新自组装成有序的晶格结构。乳酸菌是与人类关系密切的益生菌，能够维持肠道生态平衡，它的代谢产物能降低肠道pH,抑制病原菌在胃肠道的粘附、生长和产毒作用，具有防止便秘、帮助消化、增强机体免疫等功效。乳酸菌进入胃肠道，首先要定植在胃肠道上，才能发挥益生功能，粘附是首要的步骤。根据文献报道，乳酸菌的S层蛋白与其粘附过程有关。基于S层蛋白的自组装特性和乳酸菌S层蛋白的粘附性这两方面的认识，本论文旨在研究S层蛋白对药物输送载体的改良功效。即S层蛋白自组装在药物输送载体—海藻酸钙微球上，研究S层对微球的缓释及微球对肠道组织吸附性能的影响。实验中选择提取瑞士乳杆菌的S层蛋白，首先通过两种途径对S层蛋白的提取进行了优化：优化瑞士乳杆菌培养基，提高单位时间内菌体量；比较不同的变性剂在不同浓度、不同pH条件下的提取效果，使S层蛋白的纯度和量达到良好的水平。继而通过荧光显微镜、扫描电镜、SDS检测S层蛋白对微球的吸附情况。在培养基优化实验中，首先通过Plackett-Burman实验设计筛选出了对菌体量具有显著影响的因素，分别是葡萄糖、牛肉膏和柠檬酸铵。然后进行了最陡爬坡实验逼近最佳响应区。最后利用Box-Behnken实验设计进行响应面优化后的最佳培养基组份为蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，乙酸钠6.25g/L，吐温801.25g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，牛肉膏8.96g/L，葡萄糖9.47g/L，柠檬酸铵3g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.0625g/L。优化后的培养基使菌体干重提高了将近66%。不同变性剂脲素、盐酸胍、氯化锂在不同浓度和pH条件下S层蛋白提取效果的比较中，脲素提取的蛋白量很少，盐酸胍和氯化锂提取的蛋白量通过电泳检测差别不大，都比较多，但是盐酸胍提取方法杂蛋白较多，所以最后选择（pH=2）5M氯化锂提取S层蛋白。通过荧光显微镜、扫描电镜、SDS方法证实了S层蛋白能吸附到海藻酸钙微球上，吸附过程发生的非常快，推测是引起吸附的作用力是静电引力。关键词：瑞士乳杆菌；S层蛋白；吸附；海藻酸钙微球；OptimizationofculturemediumforLactobacillushelveticus,isolationandapplicationofsurfacelayerproteinsAbstractS-layerproteinsrepresenttheoutmostcomponentofmanybacteriaandarchaea.EachS-layerproteiniscomposedofasingleproteinorglycoprotein,scarcelyoftwoormoreproteinspecies,andformscrystallinearrays.TheS-layerproteinsubunitsarenon-covalentlylinkedtoeachotheraswellastothesupportingcellwall,andcanbedisintegratedintomonomersbyhighconcentrationofhydrogenbond-disruptingagentssuchasurea，lithiumchlorideorguanidinehydrochloride.Thecontentofnon-polaraminoacidsoftheS-layersequencesisrelativelyhigh,resultingintheirhydrophobicproperty.Thatisthereasonoftheirabilityofself-assemble,whichmeansisolatedS-layersubunitscanrecrystallizeintoregulararraysinsuspension,air-liquidinterfaces,onsolidsupports,orlipidfilmsandliposomesoncethedisruptingagentusedfortheirisolationhasbeenremoved.Lacticaci