水淹胁迫下nadph氧化酶atrbohd的功能分析-functional analysis of nadph oxidase atrbohd under flooding stress.docxVIP

摘要涝害是我国的主要农业灾害之一。涝害可对植物产生水淹胁迫，水淹胁迫则导致植物缺氧。研究表明，活性氧（ROS）作为信号分子在植物应答缺氧胁迫反应中起重要作用，然而ROS是否参与水淹胁迫，其来源及作用的分子机制如何目前还不太清楚。我们以拟南芥NADPH氧化酶基因突变体atrbohD、转基因植物以及其它缺氧信号转导相关突变体为材料，利用生物信息学、分子生物学、植物生理学等手段研究发现，NADPH氧化酶AtrbohD通过产生H2O2参与植物应答水淹胁迫的反应。首先，得到了AtrbohD基因的T-DNA插入纯合突变体(atrbohD1、atrbohD2)、超表达植株及GUS转基因植株。RT-PCR分析表明AtrbohD基因在T-DNA插入突变体中没有表达。土壤表型分析发现，突变体atrbohD对水淹很敏感，与野生型及超表达植株相比成活率明显降低。RT-PCR和荧光定量PCR分析表明，在水淹处理下WT植株中AtrbohD基因的表达量显著增加；突变体植株中乙醇脱氢酶基因（ADH1）（缺氧信号转导的标志基因）表达明显低于WT植株，而超表达植株中ADH1表达量高于WT植株。另外，对AtrbohD::GUS转基因植株进行组织化学定位和GUS活性测定，表明水淹可以诱导AtrbohD基因的表达，水淹胁迫下突变体幼苗中H2O2含量明显低于WT；该基因超表达后，缺氧条件下植物产生H2O2的量比WT高。这些结果表明，AtrbohD通过产生H2O2参与了植物水淹信号转导。为进一步确定AtrbohD的作用机制，我们获得了ADH1基因启动子的GUS转基因植株（分别转化WT、atrbohD1和DN-rop2），水淹后ADH::GUS转WT植株染色有所加深；而转atrbohD1和DN-rop2植株染色几乎没有变化。转AtrbohD基因启动子的GUS转基因植株（分别转化WT、CA-rop2（组成型激活）和DN-rop2（显性负控制）），水淹后AtrbohD::GUS转WT和CA-rop2的植株颜色都加深；而转DN-rop2植株的颜色几乎没有变化。ROP2基因启动子的GUS转基因植株（分别转化WT、atrbohD1），水淹后ROP2::GUS转WT及atrbohD1的植株染色都加深；另外，测定了不同基因启动子的GUS转基因植株在水淹后GUS活性变化，其结果与染色结果一致。利用RT-PCR和荧光定量PCR技术测定水淹条件下基因AtrbohD缺失及超表达后对ROP2及ADH1基因表达的影响，水淹后ROP2基因的表达在atrbohD1与WT中明显被诱导，并且随时间延长表达量逐渐增大。在正常条件下各植株ADH特异活性与WT相似；水淹处理下，WT和atrbohD中的ADH特异活性均增加，但与WT相比，atrbohD中水淹诱导的ADH特异活性受到明显抑制。另外，水淹处理rop2、CA-rop2及DN-rop2突变体，rop2、DN-rop2水淹诱导的ADH特异活性受到严重抑制，特别是DN-rop2植株随水淹时间延长ADH特异活性几乎没有变化。此外，在水淹胁迫下，atrbohD中H2O2含量增加的速度明显慢于WT；而且随处理时间的延迟，这种效应更加明显。另外，水淹后突变体rop2、DN-rop2中H2O2增加的速度明显低于WT，而CA-rop2中的H2O2增加的速度比WT快。AtrbohD基因超表达后，水淹处理后产生H2O2的速度显著快于WT。总之，这些结果表明AtrbohD产生的H2O2确实在水淹胁迫信号转导中发挥重要作用，并且AtrbohD可能位于ROP2的下游。关键词：AtrbohD，缺氧，水淹，H2O2，拟南芥ABSTRACTFloodingisoneofthemajordisastersinagriculture.Itoftencauseswaterloggingstresswhichresultsinoxygendeprivationinplants.Evidenceindicatedthatreactiveoxygenspecies(ROS)assignalmoleculesplayimportantrolesinplantresponsetohypoxiastress.However,thequestionswhetherROSareinvolvedinwaterloggingstressresponseandwhatarethemolecularmechanismsremainlargelyunknowntodate.Inthispaper,wedemonstratedthatAtrbohDisinvolvedintheregulationofwaterloggingstressviaproducingH2O2inArabidopsisbyusingNADPHox