基因的克隆课件.pptVIP

云南大学 基因文库的建立以及筛选 用前述方法将重组子转入宿主细胞内（如大肠杆菌等） cDNA重组克隆的筛选： 制备杂交探针，进行探针原位杂交法； 差异杂交筛选：获得某些在特定组织、细胞中或特定时序表达的目的基因； 丰度高或中等的标准差示杂交筛选差示杂交.ppt； 低丰度的cDNA：改进差示方法改进差示杂交.ppt SSH( Suppression subtractive hybridization) 基因文库的建立以及筛选 应用表达文库来分离目的基因 １．概念：表达文库是指将蛋白质编码基因（如cDNA)插入合适的表达载体中，通过筛选相应基因的蛋白质表达产物达到分离目的基因的要求。 ２．表达文库的构建：以真核生物的表达文库来说明构建策略 以cDNA文库相同的方法完成从mRNA到双链cDNA的转变； 双链cDNA与载体连接：表达文库不仅要使外源cDNA插入到表达载体启动子下游，置于启动子调控下，另一个关键问题是要使cDNA以正确的取向和编码框架插入表达载体才能确保产生正确的蛋白质。为此，最简单实用的方法就是在cDNA分子两端都装上相同的寡核苷酸衔接片段，酶切处理cDNA与载体后，进行连接，这样的结果就是cDNA可以以任何一种取向插入到表达载体上。因此cDNA可以按照两种方向插入，每一种方向可能有三种开放性阅读框架。所以建库和筛库时注意平均来讲每６个克隆才可能筛选到一个相应的正确蛋白