山羊地方性鼻内肿瘤病毒entv cdna文库的构建及功能基因的初步表达-construction of goat local intranasal tumor virus entv cdna library and preliminary expression of functional genes.docxVIP

中文摘要11111111111111111111111111111111111111111111111111Y1800829地方性鼻内肿瘤病是一种以呼吸道鼻内粘膜分泌型上皮细胞发生致瘤性转化为特征的接触性传染病，主要发生于山羊和绵羊，其临床症状主要表现为连续性鼻漏、呼吸困难、眼球突出、颅骨变形、面部肿大、喷嘴、打解和极度消瘦。除澳大利亚和新西兰外，所有其他主要养羊国家都有该病的流行，发病率为0.1%幽15%，给各国养羊业造成了较大的损失。在国内，该病主要流行于内蒙古、湖南及四川等主要养羊地区，严重影响了当地山羊种质资源的发展。目前，国内对该病病原学的研究甚少，仅有几例山羊地方性鼻内肿瘤性疾病病理学的相关研究报道。为了深入认识该病，本研究进行了以下儿方面的工作:1.山羊地方性鼻内腺瘤病毒ENTVcDNA文库的构建和基因组解析根据NCBI中收录的ENTV基因组序列设计6对引物，利用R丁-PCR技术从山羊地方性鼻内肿瘤自然感染病例的鼻液中的病毒RNA中分段扩增出相应片段，经TA克降筛选及测序鉴定，成功克隆丁重组质粒pMD-ipMD-ii、pMD-iii、pMD-iv、pMD-v、pMD-vi，构建了包含ENTV基因组序列的cDNA文障。序列分析结果显示，相应的gag编码区和env编码区均含有ENTV的独特区，与EN丁V-2(登录号:NC_004994)对应序列的相似性分别为88%、90%、93%、88%和92%，而与JSRV及ERVs的差异性较大。序列拼接结果显示，ENTV基因组序列包含5端非编码区、3端非编间区和相互重叠的gag-pro.pol-env编码区，基因组全长为7168bpoll.山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV功能基因的分子克隆及初步表达研究利用PCR技术从ENTVcNDA文库中成功亚克降了巴N丁Vgag、env、SU、TM和SD的编码区，构建了pMD-gag、pMD-env、pMD-SU、pMD-TM和pMD-SD的亚克隆，并构建了表达这些编码区的表达质粒(pE下gag、p巴GFP刷刷lV、pEGFPδU、pEGFPM和pEGFP-SD)。将重组原核表达质粒pET-gag转入宿3:菌E.coliRosetta唱aml-丁Mρ日)plysS进行表达研究，SDS幽PAGE电泳检测到大小约87ku的目的蛋白，为进一步研究gag的功能奠定了基础。重组质粒pEGFP-env、pEG陀佛SU、pEGFP-TM、pEGFP-SD转染COS-7哺乳动物细胞，12h后即可观察到荧光，外源基因转录子的R下PCR检测为阳性，说明震组质粒在启动子的驱动下可以融合荧光蛋白有效表达。关键词:山羊地方性鼻内肿瘤病毒;cNDA文库:表达cDNAlibraryconstructionandexpressionofmainfunctionalgenesofenzooticnasaltumorvirusforgoatsFengYing-chun(PreventiveVeterinaryMedicine)DirectedbyProf.YanQiguiProf.GuoWan-zhuAbstractEnzooticnasaltumour(ENT;enzooticnasaladenocarcinoma，巴NA)ofsheepandgoatsisacontagiousdiseasescharacterizedbyneoplastictransformationofsecretoryepithelialcellsintherespiratorytractofthemucosalnasalglands.Clinicalsignsincludecontinuousnasaldischarge，respiratorydistress，exophthalmos，skulldeformations，facialswelling，sneezingandsnoringrespirationandweightloss.丁hediseaseoccursnaturallyinal1continentsexceptAustraliaandNewZealand，theprevalenceinsheepwasfoundtobeabout0.1%-15%.EpidemiologicaldateindicatesthatENTprevalen民ínthesheepareωsuchasInnerMongolia，HunanandSichuan，etc，whichseriouslyaffectedthedevelopmentofgermplasmresourcesoflocalgoats.Therehasbeenlittles阳diedintheaetiologyandpathophysiologyo