山羊bmscs的体外分离培养和生物学特性的分析及腺病毒扩增的实验分析-isolation, culture and biological characteristics of goat bms cs in vitro and experimental analysis of adenovirus amplification.docxVIP

疗研究奠定前期的实验基础。目的1、寻找简单可靠的方法对山羊骨髓间充质干细胞进行体外分离培养与鉴定，并研究其生物学特性和成骨及成脂诱导分化条件，为基因治疗及细胞工程研究提供大量种子细胞；2、批量扩增载有BMP-2与bFGF双基因的重组腺病毒，为后续的骨质疏松基因治疗研究奠定前期的实验基础。材料与方法1、选用健康中国青年山羊，骨髓穿刺法抽取骼骨骨髓，应用全骨髓培养法对骨髓间充质干细胞进行体外分离培养，倒置相差显微镜下观察细胞形态与生长情况，测定细胞成活率及传代细胞贴壁率，对第3代细胞采用CCK-8细胞计数法绘制出生长曲线，流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标志CD29、CD34，测定细胞周期，对细胞进行成骨及成脂诱导分化，并对其进行相应的碱性磷酸酶（ALP）、茜素红及油红O染色。2、准备包装细胞HEK293A细胞，进行大量传代培养，按照GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂盒说明书进行操作，批量扩增与纯化Ad-BMP2-bFGF-GFP腺病毒，置于-80?冰箱保存，测量OD260及OD280，计算病毒感染滴度及其纯度。结果1、骨髓间充质干细胞原代细胞培养的形态观察:培养后24h可见部分细胞贴壁，贴壁细胞多呈椭圆形。48h后可见更多的细胞贴壁，贴壁细胞伸出伪足，形态渐变为梭形、多角形，细胞折光性好。8～9d后可见数个细胞集落形成，显微镜下见贴壁细胞的细胞膜及细胞核清晰。随培养进行细胞集落进一步增多，细胞生长逐渐融成片状，约14d左右可长满培养瓶底90%。2、骨髓间充质干细胞传代细胞培养的形态:细胞传代后2小时开始贴壁，生长速度明显加快，5～7天贴壁率即可达80%～90%。镜下细胞多呈长梭形，细胞密度较高时呈放射状、漩涡状排列。3、骨髓间充质干细胞的细胞周期检测结果：第3代骨髓间充质干细胞细胞周期检测，G1期的细胞为74.76%,G2期的细胞为12.29%,S期的细胞为12.94%,大部分细胞处于静止期,只有少数的细胞处于活跃的增殖期。4、骨髓间充质干细胞的生长曲线:生长曲线呈S型，1~3d为潜伏期，生长速度较为缓慢;第4~9d,细胞增值迅速,为对数生长期,以后细胞生长速度减慢,进入生长平台期，生长速度趋于稳定。5、山羊骨髓间充质干细胞的活力测定：第2代至第4代BMSCs的活力均大于96.7%,第5代则有所下降，为89.8%。6、骨髓间充质干细胞的鉴定结果:第3代骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测，细胞表面抗原CD29呈阳性表达（75.6%），CD34呈阴性表达。7、骨髓间充质干细胞成骨及成脂诱导分化:第3代骨髓间充质干细胞成骨诱导分化碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色均呈阳性；第3代骨髓间充质干细胞成脂诱导分化油红O染色呈阳性。8、批量扩增腺病毒：腺病毒感染HEK-293A细胞48-72小时后开始出现CPE现象，即细胞多呈葡萄串珠样变；病毒扩增纯化后滴度为:0.5×1012VP/ml,OD260/OD280值为0.77.结论1、本研究采用全骨髓培养法从山羊骨髓中分离骨髓间充质干细胞并进行体外培养扩增，细胞生长状态良好，体外增殖能力较强，为后续实验提供大量种子细胞。2、通过鉴定细胞表面抗原标志，诱导成骨及成脂分化，结合形态学观察，证实研究中所分离培养细胞是骨髓间充质干细胞。3、成功地对Ad-BMP2-bFGF-GFP腺病毒进行批量扩增与纯化，为后续的骨质疏松基因治疗奠定了实验基础。关键词山羊；骨髓间充质干细胞；分离培养；生长曲线；鉴定；腺病毒；扩增论文类型：应用基础Experimentalstudyofisolation,cultureandcharacteristicsofgoatBMSCsinvitroandamplificationofadenovirusGraduate:WuHai-fengTutor:GuoQi-fengGuangzhouMedicalCollege,GuangzhouFirstPeoplesHospital,Guangzhou510180Background:AbstractBonemarrowmesenchymalstemcells(bonemarrowmesenehyma1StemCells,BMSCs)whichisderivedfromearlyembryonicdevelopmentinanimalsisaclassofmesodermalpluripotentstemcells,mainlyintheorgansofthebodyandtheinterstitialconnectivetissue,andwiththehighestdenseinthebonemarrow.Bonemarrowmesenchymalstemcellshavethepotentialofself-renewalcapacity