芍药苷对黑素瘤a375增殖及nf κb影响的研究-effects of paeoniflorin on proliferation and nf κ b of melanoma a375.docxVIP

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2018-07-31 发布于上海
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芍药苷对黑素瘤a375增殖及nf κb影响的研究-effects of paeoniflorin on proliferation and nf κ b of melanoma a375

中文摘要目的探讨不同浓度芍药苷（paeoniflorin，PF）对人黑素瘤细胞株A375细胞增殖抑制率、细胞凋亡率的影响以及对该细胞株p16INK4a、p14INK/ARF、核因子-κB（NF-κB）亚基p65的mRNA水平的影响，为其临床应用及进一步深入研究提供基础。方法以A375细胞为研究对象，设定空白对照组及5个相应实验组，芍药苷含量分别为0、0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml培养液处理（芍药苷纯度≥92%）。①倒置显微镜观察各组细胞密度及形态的变化；②MTT比色法检测在干预24、48和72小时后各浓度药物对A375细胞的增殖抑制率的作用；③AnnexinV/PI试剂盒染色后，采用流式细胞仪检测在干预24小时后各浓度药物对A375细胞的早期凋亡率的影响；④SYBRGreen-PCR检测在干预24、48和72小时后各组A375细胞p16INK4a、p14INK／ARF、NF-κB亚基p65的mRNA水平的影响。结果1、倒置显微镜观察显示芍药苷能抑制A375细胞的生长，随着浓度的增大其密度减小，细胞逐渐呈现短而粗的树枝状胞体，而不是正常的细长样核周体和双极树突样胞体。2、MTT结果显示芍药苷能抑制A375细胞的增殖，且其抑制作用呈浓度依赖性，而无时间依赖性。3、AnnexinV/PI染色法-流式细胞仪结果显示各组中A375细胞的早期凋亡率无显著差异（P＞0.05）。4、SYBRGreen-PCR结果显示：①芍药苷能促进A375细胞p16INK4a的mRNA转录水平，与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），且其促进作用呈浓度依赖性，而无时间依赖性；②芍药苷能抑制A375细胞中NF-κB亚基p65的mRNA转录，与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），且其抑制作用呈浓度依赖性，而无时间依赖性；③芍药苷对A375细胞p14INK／ARF的mRNA水平无明显影响（P＞0.05）。结论1、芍药苷能抑制A375的增殖，且呈浓度依赖性而无时间依赖性；但其对A375细胞凋亡无明显影响，可能与黑素瘤的诱导耐受性或肿瘤来源不同有关。2、芍药苷能促进A375p16INK4a的表达，抑制NF-κB亚基p65，且这种作用呈浓度依赖性而无时间依赖性；但其对p14INK／ARF的转录无明显影响。由此推测，芍药苷对A375的增殖抑制作用可能通I过促进p16INK4a，抑制NF-κB亚基p65表达而实现的。关键词：芍药苷；黑素瘤；增殖抑制率；p16INK4a；核因子-κBAbstractObjectiveToinvestigatetheeffectsofdifferentconcentrationsofPF(paeoniflorin)onthecellproliferationinhibitionrateandcellapoptosisrate,andtheeffectsonthemRNAtranscriptionlevelofp16INK4a、p14INK／ARFandp65,onesubunitofnuclearfactor-κB(NF-κB)inhumanmelanomacellsA375,withthepurposeofprovidingfoundationforclinicalapplicationandthefurtherstudy.MethodsHumanmelanomacellsA375werecultured,dividedintotheblankcontrolgroupwithoutPFandfivecorrespondingexperimentalgroup,whichpretreatedwithPFcontents0.01mg/ml,0.1mg/ml,0.5mg/ml,1.0mg/mland2.0mg/ml.ThePurityofPF≥92%.(1)ObservethechangesindensityandshapeofA375cellsbyinvertedmicroscope;(2)DetecttheeffectofcellproliferationinhibitionratebyMTTonhumanmelanomacellsA375,whichculturedfor24hours,48hoursand72hourswiththedrugs;(3)DetecttheeffectofapoptosisratebyAnnexinV/PIstainingkitandflowcytometryonA375,whichculturedfor24hourswiththedrugs;(4)ThemRNAtranscriptionlevelofp16INK4a，p14INK／A