《中国医科大基础医学遗传学》课件 基因操作.ppt

Chapter 9 基因操作 （中国医科大学医学遗传学教研室 ）;第九章 重点内容提示; Chapter 9 基因操作 ;; 第一节 重组DNA技术---基因工程 ; 一、限制酶 ;1、限制酶的命名 ;2、限制酶识别序列和切割形式 ;;5’ － C T G C A G － 3’ 3’ － G A C G T C － 5’;互补末端连接;;产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：;3、特点： ;二、基因运载体及其选择 ;载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。 常用的载体：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。 ;（一）质粒 plasmid ; 常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色色。从而筛选阳性菌落。;?（二）.λ-噬菌体(λphage);置换λ载体 – 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。 插入载体 – 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。 ;裂解途径;（三）.粘粒(cosmid vector)（30~50kb） ;(四) 大片段DNA克隆载体 ;1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC） ;2、噬菌体PI载体和PAC ;3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）;;YAC 的主要功能成份有三： ;三、DNA重组与分子克隆化 ; 基本原理与过程： ;分离纯化目的基因目的基因 + vector =重组DNA分子;vector;ligase;重组DNA 和 分子 克隆 ;重组DNA和分子克隆的几种方法：;筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone） ;筛查含有目的基因的细胞克隆;从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 ;;四、目的基因表达 ;目的基因表达 ;（一）．真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达 ;(二)、真核细胞基因在真核细胞中表达 ;第二节、基因文库;;Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage λ vector ;二、染色体特异的基因文库  （ chromosome specific library） ; 三、cDNA文库（cDNA library） ;第三节 分子杂交及相关技术 ;分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。 双链probe或DNA解链，主要取决于： 1．链的长度：链越长，需要的 能量多才能解链； 2．碱基成分：GC含量高，较难变性； 3．化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链 ;一、基因探针（gene probe）;（一）. 探针的种类与制备 ;DNA克隆;2、cDNA probe :从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。 ;3、寡核苷酸probe: ;（二）探针的标记 ;1、缺口平移法 （Nick Translation）;Nick Translation;2、随机引物法（6核苷酸引物标记法） ;随机引物标记探针;3、DNA末端标记;二、DNA杂交常用的方法 ;Southern Blot;- +;2、应 用: ;(二).斑点杂交(dot and slot hybridization) ;DNA 样品;（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele-specific-oligonucleatide,ASO） ;例:PKU产前诊断;三、Northern blot ;Norther Blot;2、应用：;四、Western blot ;West Blot ;Western blot;五、聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） ;;PCR;ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC;原 理：;PCR扩增;PCR特点及应用：;PCR相关技术： ;2)巢式PCR（nest PCR）;在同一PCR体系中加入若干