肾癌细胞中内源性wnt以自分泌方式刺激fzd7胞吞作用-endogenous wnt in renal cell carcinoma cells stimulates fzd 7 endocytosis by autocrine.docxVIP

中文摘要肾癌细胞中内源性Wnt以自分泌的方式刺激Fzd7的胞吞作用织相比，Fzd7在癌组织中过表达，说明Fzd7在肿瘤发展过程中发挥作用；westernblot结果显示，三株RCC细胞中，Fzd7存在多条主条带，包括Fzd7单体64kD，以及60kD，35kD两条条带，内切糖苷酶H和N-糖苷酶F处理对Fzd7在三种RCC细胞中的条带分布无显著影响，说明这三条条带并非Fzd7未成熟的糖基化形式，那么分子量小于64kD的条带很有可能是未完成合成的Fzd7或者是Fzd7胞吞后被降解的条带。【结论】确定了ccRCC组织及RCC细胞中存在Fzd7的表达，为进一步研究RCC细胞中Wnt诱导Fzd7的胞吞作用提供了研究基础。二、内源性Wnt诱导Fzd7的胞吞作用的研究【目的】研究RCC细胞中内源性Wnt信号分子诱导Fzd7受体的胞吞作用。【方法】体外培养RCC细胞系786-O、OS-RC-2、Caki-1细胞，采用RT-PCR和Real-timePCR检测几种经典Wnts的表达；用Wnt分泌抑制剂IWP-2、Clathrin抑制剂氯丙嗪和caveolae抑制剂制霉菌素处理细胞后，westernblot检测Fzd7蛋白的变化，以及IWP-2处理后细胞总蛋白中β-catenin和磷酸化β-catenin、细胞浆中β-catenin以及细胞核中β-catenin的变化；Real-timePCR检测RCC细胞中Fzd7的表达水平，通过Fzd7shRNA、GFPshRNA转染786-O细胞，并通过Wnt3a处理Fzd7shRNA/786-O和GFPshRNA/786-O细胞，MTS分别检测细胞的增殖率。【结果】Westernblot结果显示，Wnt分泌抑制剂IWP-2作用于RCC细胞后，可显著增加Fzd7单体64kD条带；Clathrin抑制剂氯丙嗪作用786-O细胞后，Fzd7单体以剂量依赖性的方式增加，而caveolae抑制剂制霉菌素则对Fzd7表达无明显影响，说明内源性Wnt主要通过clathrin介导刺激Fzd7的胞吞作用。不同浓度的IWP-2处理RCC细胞，10uMIWP-2处理后，可显著增加磷酸化β-catenin水平，并降低总β-catenin水平，此外，IWP-2可抑制OS-RC-2细胞中β-catenin的核转移，说明IWP-2可一定程度上抑制经典通路的激活，且可推断RCC细胞中内源性Wnt激活经典通路。Real-timePCR结果显示，786-O细胞中Fzd7mRNA水平显著高于OS-RC-2以及Caki-1细胞；细胞增殖实验显示，与GFPshRNA质粒转染相比，Fzd7shRNA转染可显著降低786-O细胞的生长速度；Wnt3a处理Fzd7shRNA/786-O细胞和GFPshRNA/786-O细胞，可诱导细胞增殖，且Fzd7shRNA/786-O细胞增殖速度高于GFPshRNA/786-O细胞，说明Fzd7在肾细胞癌细胞的增殖过程中发挥作用。肾癌细胞中内源性Wnt以自分泌的方式刺激Fzd7的胞吞作用中文摘要【结论】RCC细胞中，内源性Wnt激活经典信号通路，诱导Fzd7的胞吞作用，并且这一作用由Clathrin途径参与介导，此外，Fzd7在肾细胞癌细胞的增殖过程中发挥作用。关键词：Fzd7；Wnt；β-catenin；肾细胞癌细胞（RCC）；胞吞作用；作者：徐荣指导老师：章良英文摘要肾癌细胞中内源性Wnt以自分泌的方式刺激Fzd7的胞吞作用AutocrineWntscontributetorenalcellcarcinomacellproliferationviastimulatingFzd7endocytosisAbstractWntproteinsaresecretedglycoproteinsthatbindtotheN-terminalextra-cellularcysteine-richdomainoftheFrizzled(Fzd)receptorfamily.TheFzdreceptorscanrespondtoWntproteinsinthepresenceofWntco-receptorstoactivatethecanonicalandnon-canonicalWntpathways.OverexpressionofWntsandFzdsortheexpressionofaconstitutivelyactiveFzdhavebeenlinkedtoWnt/β-cateninpathwayactivationinvarioustumors.ThereareseveralresearchessuggesttheinvolvementofWntsignalingpathwayinRCC.AsamemberofF