人巨细胞病毒潜伏激活感染诊断的进展ppt课件.pptVIP

免疫组织化学技术; 免疫组织化学技术;阳性患者;图20 伊文氏蓝复染效果图 A.阳性标本检测效果 B.阴性标本检测效果 C.阳性标本复染后的效果 D.阴性标本复染后的效果;一、免疫组化技术介绍;（一）标本制作;标本的类型—组织切片、印片、涂片。;2.组织切片;;;切片要求及注意事项： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片） ;标本的固定;标本的保存（温度、时间）;标本的预处理（目的、注意点） ;抗原修复(Antigen Retrieval;AR);胰蛋白酶 0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37℃ 30min。 胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCI稀释，消化时间37℃ 30～180min。 蛋白酶K 20μg/ml，用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制，消化时???37℃ 20～40min。 链酶蛋白酶 0.1%，用pH 7.4,0.5M Tris-Hcl稀释，消化时间37℃ 1～4h。 无花果蛋白酶 0.1%浓度，用0.2M pH7.4 PBS稀释，消化时间37℃ 30～60min。;（二）抗体的选择;;标记抗体;;抗体最佳稀释度的测定 直接测定法;（三）抗原/抗体反应（温育）;（四）改善标本的通透性;（五）对照项的设立;（六）检测结果的判断;;二、酶免疫组织化学技术;二、酶免疫组织化学技术;（一）酶标记抗体免疫组化染色法 1、直接染色法 （一步法）： 原理：待检标本+酶标记抗体～+底物显色 技术要点：除内源性酶、封闭、镜下观察 ;直接法;2、间接染色法 （二步法）： 原理：待检标本+非标记特异性一抗+酶标记 二抗～+底物显色 技术要点：同前;间接法;（二）非标记抗体酶免疫组化染色法 非标记抗体酶免疫组化染色中，酶不是直接标记在抗体（一抗/二抗），而是经抗酶抗体与酶结合，它既用于抗原检测，也可用于抗体检测。 常见的：1、酶桥联法；2、过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；3、双桥PAP；4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP） ;;2、过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法: ;酶 — 抗酶抗体复合物;PAP; 特点： ①未经化学交联不影响抗体和酶的活性 ②由2个抗酶抗体和3个酶分子，稳定性好 ③本身不存在游离免疫球蛋白，非特异少 ④但复合物制备繁琐;;3、双桥PAP法: PAP的改良 呈Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP 敏感性提高, 操作太复杂。 ;双PAP法;;APAAP法;三、免疫电镜技术;免疫电镜成功的关键： ①细胞超微结构要求保存完好 ②细胞或亚细胞结构的抗原位点保持不变 ③免疫试剂应选择通透性好 ④标记免疫物与待检抗原结合性好（特 异、稳定） ;三、免疫电镜技术（方法）;1、铁蛋白标记免疫电镜技术 原理：铁蛋白标记抗体，保留抗体免疫活 性并具高电子密度，与待检抗原结 合，在电镜下易见。 技术要点：①铁蛋白标记抗体的制备 标记方法：A、一步法 B、二步法 ②免疫电镜样本的制备 制备法：A、包埋前免疫染色 B、包埋后免疫染色 ;免疫电镜样本的制备中包埋前免疫染色： 固定—免疫组化染色—包埋、切片镜检 免疫电镜样本的制备中包埋后免疫染色： 固定—包埋、切片—免疫组化染色，镜检 ;2、酶标记免疫电镜技术;酶标记免疫电镜技术是将电镜高分辨力与酶 免疫技术的高灵敏与特异性相结合～ 常用酶：水解酶 氧化酶（HRP）+ DAB（底物） 转化酶 DAB– 3、3二氨基联苯胺。易氧化聚合～系 列反应后+锇酸——高电子密度的锇黑。 技术分类:(用否酶标抗体、何时用？);1）酶标记抗体包埋前免疫染色法;2）非酶标记抗体法（PAP法） ①不是用酶直接标记的抗体，而是用（酶蛋白：抗酶蛋白抗体）自然结合物； ②操作包括包埋前免疫染色/包埋后～ ③复合物分子大，穿透组织细胞能力？ ④酶反应的产物会发生扩散？;3、胶体金标记免疫电镜技术;各类标记免疫电镜技术优缺点;四、亲和组织化学技术;亲和组织化学（affinity histochemistry）：指利用两物质之间具有高度亲和力而相互结合的化学反应