西安医学院生化教研室1学会用PCR技术从质粒DNA上扩增目的基因.PPTVIP

西安医学院生化教研室 1.学会用PCR技术从质粒DNA上扩增目的基因。 2.复习PCR技术基本原理及反应过程。 实验目的 PCR技术扩增DNA片段 “他是个很活跃的孩子，常把各种东西混到一起。3岁那年，他把鸡蛋打碎搅成油漆，然后将房子刷成了黄色。我经常发现他几瓶子几瓶子地收集昆虫和蛆。我想他简直疯了。他对一切都入迷。今天我才知道这是因为他的思维太活跃了。” K. Mullis ( 1944 — ) 实验原理 1998年钱嘉韵在台湾国立政治大学讲座 黄石公园热泉 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 1.基本工作原理 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 1.基本工作原理 2. PCR体系基本组成成分 3. PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 概念：PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应），是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 原理：DNA复制。 条件：已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、一对引物、DNA聚合酶。 方式：以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）。 结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。 小结 过程： a.DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA； b.退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 c.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 PCR技术扩增DNA片段 实验步骤 试 剂 加样量（ul） 10×PCR buffer（含Mg2+） 5 dNTP(200μM) 4 P1(20μM) 1 P3(20μM) 1 模板DNA 1 Taq(5u/μl) 0.25-0.5 H2O 37.5 总体积 50 PCR技术扩增DNA片段 实验步骤 【使用Control Primer 1、2时（扩增6,012 bp DNA片段）】 94?C 预变性 5 min 94?C 变性 1 min 68?C 退火、延伸 4 min 72?C 终延伸 5 min 4 ?C hold 30个循环 PCR技术扩增DNA片段 实验步骤 【使用Control Primer 1、3时（扩增500 bp DNA片段）】 94?C 预变性 4 min 94?C 变性 30 sec 55?C 退火 30 sec 25个循环 72?C 延伸 30 sec 72?C 终延伸 2 min 4 ?C hold 加入8ul 6×loadingbuffer 准备电泳 实验结果 M 1 2 M M ： λ - EcoT 14 I Marker 1 ： 6,012 bp PCR 产物 2 ： 500 bp PCR 产物 7743bp 6623bp 925bp M 1 2 M M ： λ - EcoT 14 I Marker 1 ： 6,012 bp PCR 产物 2 ： 500 bp PCR 产物 7743bp 6623bp 925bp M: λ-EcoT14ⅠMarker 这是PCR的发明者、美国生物化学家穆里斯（1944－）的母亲在得知儿子获诺贝尔奖之后说的话。正如他母亲所说的，穆利斯是一个从小就拥有异常活跃的思维、独立不羁的个性和离经叛道精神的人。 * * 这是PCR的发明者、美国生物化学家穆里斯（1944－）的母亲在得知儿子获诺贝尔奖之后说的话。正如他母亲所说的，穆利斯是一个从小就拥有异常活跃的思维、独立不羁的个性和离经叛道精神的人。 * *