快速PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶.PPTVIP

PCR技术的原理和方法 PCR技术的原理 PCR反应的体系及反应过程 PCR技术的应用 PCR技术简介 ??? 聚合酶链式反应是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K．B．Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过烦琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝，所以有人亦称之为无细胞分子克隆法。 PCR技术为基因的分析与研究提供了一种强有力的手段，是现代分子生物学研究中的一项富有革新性的创举，对整个生命科学的研究与发展，都有着深远的影响。现在，PCR技术不仅可以用来扩增与分离目的基因，而且在临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控、基因突变与检测、分子进化研究，以及法医学等诸多领域都有着重要的用途。因此，在该技术问世不久，即被在科技界享有盛誉的美国“Science”杂志评为1989年度十大科技新闻之一，成为全世界引用频率最高的文献。 DNA的体内复制 PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系： 　　　10×扩增缓冲液 　 10ul　　　4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　　 　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加双或三蒸水至 　 100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 　　 PCR反应条件 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法， 双链DNA在90～95℃变性， 再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上， 然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 循环次数:25-30 cycles. 单击显示PCR反应的动画演示 PCR amit PCR反应特点 特异性强： PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结 合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。 灵敏度高： 　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速 　　PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广. 对标本的纯度要求低 　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测 PCR扩增产物的分析 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。 琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶， 供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。 　　　　 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。 斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法 单击显示 PCR 技术的原理，方法和应用 * PCR反应的体系和过程 50 PCR扩增过程 Template DNA 变性 退火 延伸 复制过程