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荧光检测在医学实验中的应用–复习题 第一章总论荧光的发生及基本检测原理 1何谓发光？ 分子吸收辐射被激发后以光的形式释放，辐射跃迁而衰变回到电子基态→发光 2荧光与磷光的区别？ 荧光：激发后马上发光，第一电子激发单重态辐射跃迁；延迟10-9～10-7秒后。基态S0→单重态S1、S2跃迁→基态。磷光：延迟时间长，几毫秒或更长10-3～10秒电子自旋未配对进入受激三重态，三重态→跃迁→基态 3完成良好荧光检测的有关条件？ 1）选择相应的激发波长2）选择足够强度的激发光源，荧光强度与入射光强度成正比If＝φfI0(1-It/I0)；3）选择合适(QE)的发射波长检测器件；4）控制好样品制备与检测环境体系。 4荧光的种类 根据激发方式。1）光化发光2）化学荧光3）生物荧光。 按荧光素的标记过程可分为：1）免疫荧光2）组织荧光3）诱导荧光 5有哪几种荧光现象？ I次荧光现象：固有或自发荧光；一经辐射就可发出荧光的物质。II次荧光现象及荧光色素(标记物)又称继发荧光；样品分子不能或只能发出很弱的荧光，对此类分子需先经荧光色素标记结合或插入到不发光的大分子中去，根据荧光探针的荧光分析大分子。 6影响荧光强度（If）的因素 1光化分解：荧光物质吸收光能后，某些键断裂，导致荧光弱。制片时应避光。2荧光淬灭：（1）温度淬灭：加快震动弛豫而丧失振动能量；增加分子热运动高温荧光分子与液基环境中分子碰撞。温度适宜或低温。（2）浓度淬灭：浓度大时发光分子在样品中分布不均，深部的分子吸收不到光子，量子产额反而小。生成二聚体或多聚体，改变吸收光谱，If降低。（3）杂质淬灭：静态淬灭，杂质与荧光分子组成另一种化合物。环境净化。碰撞、转入三重态淬灭。3pH影响：破坏荧光物质环链结构，芳香族化合物的酸、碱功能团对pH敏感。 7半波宽定义：最大透光度Tmax波长1/2处对应的两波长差(λ1 -λ2)也称带宽(Bandwidth),带宽窄则光色纯。 第二章荧光成像检测 1光学显微镜分辨率定义及简易计算公式 2影响光学显微镜分辨率的主要因素？ 影响分辨率的因素为衍射效应：圆斑像AIRY斑，阻碍分辨率。 3聚光镜与物镜孔径光阑的对应调节？ 目的：产生与物镜相应的光束，使镜像的反差和焦深处于最佳状态。不同倍率物镜有不同的NA值，改换物镜聚光镜NA应做相应调节。观察：与物镜NA一致(100%)，以得到较好的分辨率；照像：相当于物镜NA的60~80%,以得到较好的反差、焦深。 4光学显微镜的有效放大＝所用物镜NA值的500～1000倍 5荧光量子效率（QE） 荧光量子效(产)率=放射量子数／吸收量子数 6医学实验中荧光检测常用的荧光检测传感器是哪两种？ 1转换光学信号为电子信号-光学传感器,2彩色CCD 7显微镜照相术的定义? 将显微镜视场中的微观图像记录为放大图像的技术 8影响CCD成像效果的主要因素是什么? 温度和灵敏度，CCD工作时，表面会产生热量，使得在芯片形成暗电流，暗流将增加噪音、降低信噪比、导致降低成像质量。 9 CCD成像放大倍率的计算公式 显示或照片倍率＝OBJ倍率×光学适配器倍率×显示或照片对角线长度／CCD对角线长度 10荧光显微镜CCD成像与激光共焦显微镜成像的比较 数字CCD优点：价低，使用简便，成像块，测得FI同LSCM，彩色还原好，图像近于镜下，光化淬灭伤害小。Ratio测钙、使用TC板，适于标本：薄、层次简单。缺点：厚标本图像质量差，无光切功能，整合功能配置价格不菲 激光共焦扫描显微镜，优点：分辨率高，光切片，3D空间立体结构观测，集成荧光分析功能。缺点：成本高（专人、耗材），光化淬灭伤害较大 11免疫荧光染色的目的 将抗体标记上荧光素（如FITC、TRITC），与细胞内相应抗原（目标蛋白）结合后，通过观察、检测具有特征性的荧光，定性、定位及定量的显示和检测细胞内目的蛋白 12.免疫荧光染色常用方法 直接法、间接法和双标记法 13.影响免疫荧光染色结果的主要因素有 1）荧光染料标记的抗体的浓度，2）溶液的pH值，3）溶剂 14.举例说明自发荧光主要包括哪些 动物中一般为黄素类和卟啉类，植物中为叶绿素容易产生自发荧光。脂褐素的自发荧光，弹力蛋白和胶原UV激发下呈黄绿色荧光，培养死细胞很容易产生自发荧光。 15.免疫荧光染色前对细胞接种密度的要求 细胞密度：根据实验目的调整细胞接种密度。对细胞个体进行形态学观察以及定位荧光信号：细胞密度稍稀疏。使细胞充分伸展，显示出其应有的形态和结构；但也要注意保证视野内有一定数目的细胞，以便选取有代表性的细胞采图，要求细胞所占面积不低于视野的20%。 定量测定荧光强度（观察某种蛋白的表达量）：细胞密度应稍高。用于做大量细胞的统计定量，细胞至少要占到视野面积的80%；这时细胞要布满视野但相互之间还有空隙，细胞排