南海红树林真菌SBE-14培养条件的优化包云玉中山大学化学与化学.DOC

南海红树林真菌SBE-14培养条件的优化 包云玉 中山大学化学与化学工程学院 摘 要：利用SAS软件的Plackett-Burman设计法，对影响南海红树林真菌SBE－14的菌体生长和目标代谢产物Austdiol生产的培养基条件进行优化研究。首先通过干重法和HPLC检测考察了不同碳、氮源的影响，确定真菌SBE－14的最适碳、氮源分别是葡萄糖和土豆浸液。在此基础上，通过 Plackett-Burman 设计法对培养基主要因子进行筛选，所选取的8个相关因素为：土豆浸液浓度、葡萄糖浓度、海盐浓度、pH、K2 HPO4·3H2O浓度 、MgSO4·7H2O浓度、FeSO4·7H2O浓度和KCl 浓度，以真菌SBE－14菌体干重（Y1）和培养液中Austdiol浓度(Y2 )为响应值。结果表明：菌体生长的主要影响因子为葡萄糖（P＝0.004906）和 K2 HPO4（P＝0.005699）；目标代谢产物Austdiol代谢量的主要影响因子为葡萄糖、海盐、K2 HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O 和 FeSO4·7H2O。 1. 前言 在过去的十几年里，红树林栖息地被证明是真菌新种属的丰富来源[1-3]。Kupka [4]等报道了从红树林担子菌 (basidiomycetes)Halocyphina villosa 的培养液中分出干蠕孢菌素siccayne。Siccayne 在浓度10-50 μg/ml 对革兰氏阳性细菌和一些真菌有中等强度的活性。Siccayne 能抑制核苷前体进入DNA 和RNA 的表达。我校林永成[5]教授领导的实验小组在国内乃至世界上率先展开对红树林的内生真菌的次级代谢产物研究，从中分离得到大量的骨架新颖，药理活性好的新化合物。 本人所在的课题小组，在之前对南海红树林内生真菌SBE-14的活性代谢产物的研究中，分离得到了几种具有抗肿瘤活性的化合物[6]，如：对神经质瘤有抑制效果的Austdiol；体外抑制两种不同口腔癌细胞KB，KBv的IC50 都小于1μg/mL的Secalonic acid A等。这些化合物作为新药的先导化合物，能否最终得到实际应用，它们的产量也是一个关键的制约因素。所以，本课题将对南海红树林内生真菌SBE-14的培养条件进行优化。 我们以Austdiol为目标代谢产物，通过对影响微生物生长代谢的碳源，氮源，微量元素，以及外部环境条件等因素的改变，找出各因素对真菌SBE-14产生目标代谢产物的影响，并通过专业的统计分析软件：SAS，计算出各因素的影响因子，从而找出最利于产生目标代谢产物的最优化培养条件。 2. 实验 本文首先采用逐因子实验筛选出南海红树林真菌SBE－14最适碳源和氮源，然后采用 Plackeet-Burman 设计[7]试验优化南海红树林真菌SBE－14液体培养基组成。最后通过HPLC检测法检验不同培养基条件对代谢产物生成的影响。通过有效联合各种试验设计方法，有效地对南海红树林真菌SBE－14培养条件进行较为系统的研究，寻找最利于产生目标代谢产物的最优化培养条件，以达到大量生产目标代谢产物的目标，为其进一步深入的药理研究，甚至最终的成药，提供来源基础。 2.1 真菌SBE-14最适碳源的确定 本实验以蛋白胨为氮源，选择葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、甘露醇、丙三醇为受试碳源，分别制成培养基A、B、C、E、G、H、I、J。培养基制成后，每个500mL锥瓶分装250mL，高温消毒灭菌。接入SBE－14菌种，静置培养，每隔一周收取一批菌（每种培养基收2瓶），测定菌体干重及菌液中代谢产物浓度。平行测定两次。 通过测定菌体干重和HPLC分析，得出以下结论：真菌SBE-14对葡萄糖利用最好，优于其他糖类，对非糖类C源的利用最差（见图1）。实验确定真菌SBE-14的最适碳源是葡萄糖。 图1 不同C源对真菌SBE-14生长的影响 2.2 真菌SBE-14最适氮源的确定 以葡萄糖为碳源，选择干酪素、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、尿素、硝酸钾、硫酸铵、土豆浸液、玉米浸液、带鱼蛋白胨为受试氮源，分别制成培养基a、b、c、d、e、f、g、h、i、j。 真菌SBE-14在土豆培养基中生长最旺盛（见图2）。实验确定真菌SBE-14的最适氮源是土豆浸液。 图2 不同N源对真菌SBE-14生长的影响 2.3 Plackett-Burman 法初步优化培养基组成 本试验以 X1 (土豆浸液浓度) , X2 (葡萄糖浓度)、X3(海盐浓度)、X4 (pH)、X5 (K2 HPO4·3H2O浓度)、X6 (MgSO4·7H2O浓度)、X7 (FeSO4·7H2O浓度)、X8 (KCl浓度) 为自变量，以真菌SBE－14菌体干重（Y1）和培养液中Austdiol浓度(Y2)为响应值，根据 Placke