铁调素对骨代谢影响的实验分析-experimental analysis of the effect of iron - regulated hormone on bone metabolism.docx

中文摘要铁调素对骨代谢影响的实验研究 中文摘要 铁调素对骨代谢影响的实验研究 铁调素对骨代谢影响的实验研究中文摘要 铁调素对骨代谢影响的实验研究 中文摘要 PAGE PAGE IV PAGE PAGE VII 本项目研究路线图 血清指标铁代谢指标骨代谢指标CCK 血清指标 铁代谢指标 骨代谢指标 CCK8 检测 ALP 染色 Van Gieson 染色 Von Kossa’s 染色 CCK8 检测 TRAP 染色 TRAP-5b 测定 基因检测 铁蓄积小鼠 一 小鼠 二 小鼠  成骨细胞 破骨细胞不同浓度铁调素 破骨细胞 铁调素对骨 代谢的影响 三 RAW264.7 细胞 第一部分 铁调素基因缺失对小鼠铁代谢及骨代谢的影响 目的 观察 C57BL/6 小鼠在 hepcidin 基因敲除后，铁代谢与骨代谢变化情况， 分析 hepcidin 基因缺失对小鼠铁代谢及骨代谢的影响。 方法 将 7 月龄小鼠根据基因型分为 2 组：hepcidin 基因敲除小鼠（hepc-/-小 鼠）与野生型小鼠（hepc+/+小鼠），每组 10 只，检测小鼠体重、血清铁、铁蛋白、血 清Ⅰ型胶原交联 C-末端肽（cross-linked C-lelopeptide of type Ⅰ collagen, CTX）水平、 血清骨钙素水平、肝脏和骨组织铁浓度、肝脏与骨组织普鲁士蓝染色、骨骼远端 Micro-CT。 结果 两组小鼠体重及血清 CTX 水平无明显差异，hepc-/-小鼠的血清铁、铁蛋 白、肝脏和骨组织铁浓度指标均显著高于 hepc+/+小鼠，差异有统计学意义，普鲁士蓝 染色进一步证实肝脏和骨组织存在严重的铁沉积；hepc-/-小鼠的血清骨钙素水平低于 hepc+/+小鼠，Micro-CT 结果显示：hepc-/-小鼠的骨小梁数量、厚度、密度、骨体积分 数、皮质骨的厚度、面积均低于 hepc+/+小鼠，而皮质骨内径高于 hepc+/+小鼠。 结论 C57BL/6 小鼠的 hepcidin 基因敲除后，可导致机体出现严重的铁蓄积， 并导致小鼠骨量下降，这一过程可能与小鼠的骨重建受到抑制有关。 第二部分 铁调素对 C57BL/6 小鼠原代成骨细胞分化、 增殖及功能活性的影响 目的 探讨铁调素对 C57BL/6 小鼠原代成骨细胞分化、增殖及活性的影响。 方法 取出生1天的C57BL/6小鼠，分离得到成骨细胞，将不同浓度的铁调素 加入细胞培养基，用CCK-8法检测细胞的增殖活性；对细胞进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色、Van Gieson染色和Von kossa’s染色。 结果 CCK-8检测结果显示铁调素对C57BL/6小鼠原代成骨细胞的增殖无抑 制及促进作用（0-800nmol/L），在400nmol/L浓度组，ALP染色面积明显较对照组高， Van Gieson染色也提示该浓度组阳性面积明显增大，其他剂量组无明显差异。各剂量 组Von kossa’s染色无明显差异。 结论 铁调素对 C57BL/6 小鼠的增殖及矿化无显著影响，但在一定剂量范围 内，可促进其分泌Ⅰ型胶原及 ALP 的表达。 第三部分 铁调素对小鼠单核细胞 RAW264.7 向破骨细胞分化的影响 目的 探讨铁调素对小鼠单核细胞株RAW264.7向成熟破骨细胞分化的影响。 方法 将不同浓度铁调素加入含有核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand， RANKL）的RAW264.7细胞培养基，24 h 后用 CCK-8 法检测细胞的增殖活性； 4d 后对细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶 （Tratrate-resistant acid phostase，TRAP）染色，光镜下观察；用RT-PCR法检测TRAP、 组织蛋白酶K（CTK）、金属蛋白酶9（MMM-9）基因表达；用酶联免疫吸附法 （enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）检测上清液中TRAP-5b含量；24h后 用共聚焦显微镜（CLSM）测定细胞内铁离子浓度。 结果 铁调素在0～800nmol/L浓度围内可增加RAW264.7细胞TRAP染色阳性 数目，上调TRAP、CTK和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）基 因表达，增加上清液TRAP-5b含量（P0.05），同时增加RAW264.7细胞内铁离子浓度 （P0.05）。 结论 铁调素可以促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化，其作用机制可能与铁 调素增加细胞内铁离子有关。 关键词：铁调素 骨代谢 铁蓄积 成骨细胞 破骨细胞 作 者：沈光思 指导教师：徐又佳