细粒棘球绦虫egagb81重组抗原和egagb81-egagb82重组嵌合抗原表达系统的构建和血清学诊断价值的比较-comparison of the construction and serological diagnostic value of the recombinant egagb 81 antigen and egagb 81 - ega gb 82 chimeric antigen expression system of e.docxVIP

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2018-08-10 发布于上海
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细粒棘球绦虫egagb81重组抗原和egagb81-egagb82重组嵌合抗原表达系统的构建和血清学诊断价值的比较-comparison of the construction and serological diagnostic value of the recombinant egagb 81 antigen and egagb 81 - ega gb 82 chimeric antigen expression system of e.docx

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细粒棘球绦虫egagb81重组抗原和egagb81-egagb82重组嵌合抗原表达系统的构建和血清学诊断价值的比较-comparison of the construction and serological diagnostic value of the recombinant egagb 81 antigen and egagb 81 - ega gb 82 chimeric antigen expression system of e

新疆医科大学硕士学位论文新疆医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 1 细粒棘球绦虫 EgAgB8/1 重组抗原和 EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组嵌合抗原表达系统的构建和血清学诊断价值的比较研究生：古力帕丽.麦曼提依明导师：吾拉木.马木提教授摘要目的：构建 pET32a-EgAgB8/1 原核表达载体和 pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2 原核表达载体，并诱导表达和纯化细粒棘球绦虫 EgAgB8/1 重组抗原和 EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组嵌合抗原，比较两个重组蛋白对囊型包虫病（CE）的血清学诊断价值。方法：从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总 RNA，反转录生成 cDNA，以此 cDNA 为模板，用基因特异性引物分别扩增 EgAgB8/1 和 EgAgB8/2 基因编码其分泌型多肽的片段，经测序后，以此两条基因片段为依据，扩增 EgAgB8/1 抗原编码核酸序列和人工合成 EgAgB8/1-EgAgB8/2 嵌合抗原编码核酸序列，分别克隆至 pMD18-T 载体，测序鉴定其正确性。通过对 pMD18-T/EgAgB8/1 重组质粒和 pMD18-T/EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组质粒分别进行双酶切，将获得的 EgAgB8/1 抗原编码核酸序列和 EgAgB8/1-EgAgB8/2 嵌合抗原编码核酸序列，用定向克隆技术克隆至原核表达质粒 pET32a 上，测序鉴定插入片段正确性后，转化至 E.coli BL21 (DE3)LysS， IPTG 诱导 pET32a-EgAgB8/1 和 pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2 原核表达质粒，表达和纯化 EgAgB8/1 重组蛋白和 EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组嵌合蛋白，用 SDS电泳分析鉴定重组蛋白，并通过超声裂解法进行纯化，Western blot 法分别检测两个重组蛋白与中间宿主 CE 病人的血清学反应情况。结果：测序表明，EgAgB8/1 抗原编码核酸序列和 EgAgB8/1-EgAgB8/2 嵌合抗原编码核酸序列均正方向插入至 pET32a(+)质粒。SDS电泳分析显示，细粒棘球绦虫 pET32a-EgAgB8/1 和 pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2 原核表达质粒得到成功的诱导表达，分别在蛋白分子量约 28kDa 和 38kDa 处有表达条带，通过超声裂解法获得了纯化的重组蛋白。 Western blot 结果表明， EgAgB8/1 重组蛋白和 EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组嵌合蛋白均能被 CE 病人血清特异性的识别。16 例 CE 病人血清中，EgAgB8/1 重组蛋白 11 例呈阳性反应， EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组蛋白 13 例呈阳性反应。同时，用 EgAgB8/1 和 EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组蛋白检测 12 例囊虫病人的血清， EgAgB8/1 重组蛋白出现 5 例阳性反应， EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组蛋白出现 3 例阳性反应。结论：成功构建了 pET32a-EgAgB8/1 原核表达质粒和 pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2 原核表达质粒，诱导表达和纯化出 EgAgB8/1 重组蛋白和 EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组嵌合蛋白，Western blot 结果表明， EgAgB8/1-EgAgB8/2 重组嵌合蛋白对囊型包虫病的血清学诊断价值优于 EgAgB8/1 重组蛋白。关键词：细粒棘球绦虫；AgB8/1 重组抗原；AgB8/1-AgB8/2 嵌合重组抗原；血清学诊断 Establishment of Echinococcus granulosus EgAgB8/1 recombinant protein and EgAgB8/1-EgAgB8/2 chimeric recombinant protein expression cystem and the serological evaluation Postgraduate:MAIMANTIYIMING Gulipali Supervisor:Prof.MAMUTI Wulamu Abstract Objective: Construction of pET32a-EgAgB8/1 antigen prokaryotic expression recombinant plasmid and pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2 chimeric antigen prokaryotic expression recombinant plasmid , e