鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白增强抗体应答的分析-analysis of flagellin - enhanced antibody response in salmonella typhimurium.docxVIP

鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白增强抗体应答的研究 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白增强抗体应答的研究 第二军医大学硕士学位论文 第二军医大学硕士学位论文 - - PAGE 1 - - - PAGE 2 - 摘 要 一、研究背景 鼠伤寒沙门氏菌是周毛菌，菌体周身遍布鞭毛，鞭毛是由基础小体、钩状体和丝 状体三部分构成，它不仅是沙门氏菌的运动器官，而且同时还具有特殊的抗原性，称 为 H 抗原，H 抗原是沙门氏菌鉴定分型的重要依据，而且可以激发先天性免疫系统 产生应答。随着对鞭毛主要成份——鞭毛蛋白免疫作用机理的不断深入研究，逐渐发 现沙门氏菌鞭毛蛋白可以通过自身激发先天性免疫系统产生应答，以启动、增强特异 性免疫系统对其他与鞭毛蛋白相连接的抗原产生特异性的应答，发挥较强的免疫佐剂 作用，而且可以在粘膜表面诱导以 Th2 型免疫反应并且伴有 IgA 的分泌。其强大的 免疫佐剂功效随后在多种病原体疫苗的研究中获得应用，如应用于鼠疫杆菌、变异链 球菌、单核细胞增生李斯特菌、甲型流感病毒、西尼罗河病毒、和间日疟原虫等多种 病原体的表位多肽和抗原蛋白，甚至用于增强甲型 H1N1 流感病毒灭活株的免疫应 答。而且在各项实验中并没有发现各种疫苗制剂因加入沙门氏菌鞭毛蛋白引起的过敏 反应或其他不良反应，因此鞭毛蛋白作为疫苗佐剂是较为安全的。 先天性免疫不仅仅是抵抗病原体侵袭的第一道屏障，而且在识别和区分病原体、 启动获得性免疫中起了关键的作用，抗原递呈细胞尤其是树突状细胞在其中担负了非 常重要的角色。抗原递呈细胞具有所谓的模式识别受体（pattern recognition receptor， PRR），可以识别病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）。 鞭毛蛋白是一种蛋白性的 PAMP，可以被 PRR 主要是细胞表面 Toll 样受体 5（Toll-like receptor 5，TLR5）识别和区分，两者特异性结合后鞭毛蛋白即可作用于表达有 TLR5 的细胞，如上皮细胞、内皮细胞、粒细胞、单核细胞、T 淋巴细胞、NK 细胞、树突 细胞等，通过激活 TLR5，活化 MyD88 依赖的信号转导通路，调控 TNF-α、IL-6 和 IL-12 等促炎细胞因子的合成，上调协同刺激分子 CD80、CD86 以及 MHCⅡ分子， 从而使这些主要的抗原递呈细胞激活和成熟，摄取抗原能力增强，向引流淋巴结迁移 能力增强，从而招引、激活和分化 T 辅助细胞，最终启动获得性免疫应答，实现免疫 佐剂功效。而对于细胞胞质内部的鞭毛蛋白则主要依赖表达在细胞胞质中的 NOD 样 受体(Nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptor, NLR）家族中的 IPAF（IL-1 β -converting enzyme (ICE) protease activating factor ） 和 NAIP5（ neuronal apoptosis inhibitory protein 5）受体，其中 IPAF 受体起主要的识别作用，而 NAIP5 则可与 IPAF 联合作用，起到增强细胞对胞质内鞭毛蛋白的识别作用。 目前许多疾病的疫苗候选抗原都面临在人体内低免疫原性的问题，例如恶性疟原 虫裂殖子顶端膜抗原 1(apical membrane antigen 1,AMA-1)蛋白，临床试验表明使用铝 佐剂或 Montanide ISA720 佐剂都不能使 AMA1 在绝大多数受试者中激发出有效水平 的抗体滴度，当在铝佐剂中添加了 Toll 样受体 9（TLR9）的激动剂 CpG ODN 后， 在受试者中抗 AMA1 的抗体水平得到了极大提高，并且高滴度的免疫血清在疟原虫 体外抑制试验中的抑制率可达到 90%以上，最高者达到 96%。然而，由于在临床试 验中发现 1 例由 CpG ODN 产生的副反应，所以 CpG ODN 的安全性已成为这种 AMA 1 疫苗制剂在临床试验中进一步推进的重要障碍。 本研究工作将以作为 TLR5 激动剂的纯化沙门氏菌鞭毛蛋白（flagella filament protein，FliC）替代作为 TLR9 激动剂的 CpG ODN1826，加入到模型抗原——卵清蛋 白（Ovalbumin，OVA）和氢氧化铝佐剂的疫苗制剂中，免疫实验小鼠，观察和比较 添加鞭毛蛋白的疫苗制剂所激发的免疫应答，为鞭毛蛋白作为佐剂增强剂应用于以各 种低免疫原性候选抗原的疫苗提供实验数据。 二、研究目的 本实验拟通过大样本随机对照的研究方法，在 BALB/c 小鼠中，研究鼠伤寒沙门 氏菌鞭毛蛋白增强抗原特异性抗体应答的佐剂增强剂功效及其机制，同时与 CpG