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《菌种传代、使用、保存操作规程》 第 PAGE 6 页 共 NUMPAGES 6 页 菌种传代、使用、保存操作规程 1. 目的 本文件规定了微生物检验用菌、无菌检验用菌及抗生素检验用菌的接种、保存，传代方法及要求，适用于中心化验室进行检验用菌的接种和传代操作。 2. 适用范围 适用于中心化验室菌种管理人员进行检验用菌的接种、保存和传代操作。 3. 职责 菌种管理人员应按本程序的规定操作。 4. 参考文件及相关程序 B08(02)005 微生物实验室标准管理程序 B08(02)019 微生物检验用菌标准管理程序 B08(02)020 检验用培养基标准管理程序 5. 程序 5.1. 对照菌株名称 ·金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003〕 ·铜绿假单胞菌〔CMCC(B) 10 104〕 ·生孢梭菌〔CMCC(B) 64 941〕 ·枯草芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 501〕 ·大肠埃希菌〔CMCC(B) 44 102〕 ·白色念珠菌〔CMCC(F) 98 001〕 ·黑曲霉〔CMCC(F) 98 003〕 ·短小芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 202〕 ·藤黄微球菌〔CMCC(B) 28 001〕 ·乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B) 50 094〕 5.2. 菌种来源 中国药品生物制品检定所提供的冷冻干燥菌种（即安瓿）。 5.3. 微生物检验用菌菌悬液的制备 5.3.1. 菌种的复苏与传代 5.3.1.1. 取备妥的冷冻菌种安瓿，灭菌的毛细滴管、双碟、镊子、注射器、灭菌水及复苏菌种所需的培养基等物品，移入超净工作台。 5.3.1.2. 用75%酒精棉球擦净冷冻菌种安瓿外壁，放在灭菌双碟内，待干。 5.3.1.3. 点燃酒精灯，将安瓿的封口一端在火焰上烧灼，用灭菌毛细管吸取灭菌水或胰酪大豆胨液体培养基少许在灼热处，使其骤冷,用干燥无菌纱布包裹安瓿，安瓿掰开。 5.3.1.4. 在不离开火焰圈内，迅速用注射器抽取约0.5ml胰酪大豆胨琼液体培养基，注入安瓿内，轻轻震摇使冷冻菌块溶解、混匀，随即用注射器吸取安瓿内容物分别接种至1支胰酪大豆胨液体培养基，1支普通胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼脂斜面培养基内。 5.3.1.5 将接种后的胰酪大豆胨液体培养基以及胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼脂斜面置30～35℃恒温培养18～24小时。（接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃恒温培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖培养基中或沙氏葡萄糖营养琼脂培养基上，23～28℃恒温培养24～48小时；接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，23～28℃恒温培养5～7天，加入3～5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱制成孢子悬液。） 5.3.1.6. 取出培养物，仔细观察菌苔形态，如无杂菌，转接至2支普通胰酪大豆胨琼脂斜面中，于30～35℃恒温培养18～24小时，同时作平板分离单个菌落及涂片镜检。 5.3.1.7. 镜检呈典型的菌型后，取第1支用灭菌0.9%氯化钠溶液洗下菌苔，加液体石蜡（液体石蜡最终浓度为10%），分装至冻存管中（冻存管1ml/支）于≤-30℃条件下冷冻保存；第2支接种至胰酪大豆胨琼液体培养基中，置30～35℃恒温培养18～24小时，分装至冻存管中（冻存管1ml/支），加入液体石蜡，于≤-30℃条件下冷冻保存，作为工作用试验菌种（也称为工作用菌种）。 5.3.1.8. 每次传代应作好记录，工作菌种的标签除标明菌种名称外，还应表明菌种编号，传代次数, 传代日期，传代人，支数（冻存管编号DC02-1211-1-3-01，表示大肠埃希菌2012年11月购买的第一支菌种第3代1号冻存管；复苏菌液编号DC02-1211-1-3-01-00，表示大肠埃希菌2012年11月购买的第一支菌种第3代1号管复苏后的菌液，其中DC02表示大肠杆菌）。 5.3.1.9.每半年应对冻存管中每种菌的菌种生长情况进行一次复核试验，并记录。 5.4. 斜面接种法 5.4.1. 接种前用紫外光照射30分钟以上，并用75%酒精棉球擦拭超净工作台进行灭菌。 5.4.2. 准备好需用的培养基斜面，标签上注明菌种名称和接种日期。培养基的制备日期应在2周之内，如斜面已无凝水者不宜再用。 5.4.3. 自冰箱中取出菌种斜面，在室外温下放置约20分钟，待温度与室温平衡后，再移入超净工作台。 5.4.4. 点燃酒精灯，将菌种管斜面的棉花塞，通过火焰转动使稍稍松动，以便接种时易于拔取；为防止细菌污染，接种操作应在搪瓷方盘上方进行，以防止细菌微粒散落。 5.4.5. 再将原来已有的菌种斜面培