正常对照组血清中IL-10IL-17.PPTVIP

免疫实验设计 演讲：刘文磊5108001188 资料：李亚妃5108001165 孙建超5108001190 整理：郭丽萍5108001157 解会超5108001163 制作：李文静5108001164 IL-17,IL-10和IFN-γ在炎症性肠病中的表达 结果：正常对照组结肠黏膜局部未检测到IL-17A的表达，而UC和CD组在结肠黏膜活组织中均检测到IL-17A的表达。同样UC和CD组血清中IL-17明显增高，而正常对照组血清未检出IL-17；UC和CD组患者血清IL-10水平均较对照组升高（P0.05），且CD组明显高于UC组（P0.05）；CD、UC组与正常对照组血清中IFN-γ的表达差异大（P0.05）。 结论：IL-17A不仅在缓解期IBD患者结肠黏膜局部达，同时在其血清中高表达，提示Th17及其分泌的IL-17A在缓解期IBD患者的发病过程中起重要作用，并伴随促炎因子和抑炎性因子失调。 1.3实验方法 1.31 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷 流式细胞术酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 1.32 (1)固定细胞－把 16% 甲醛直接地加入培养 基获得一个 1.5% 甲醛的最后一个浓度。 (2)在 RT 和圆球在定色料中泡 10 分钟。 (3)Permeabilize 细胞－每一 106个细胞在 500 ul 极冷的 MeOH 中有精力充沛的旋涡再 中止圆球。这是接近编号，或多或少 MeOH 如果蒸发不是重要， cna 被用。 (4)在 4℃泡至少 10 分钟。此时，细胞以信号的较小失败力量能在 -20℃ 被储存好几个星期。 (5)然后在每一 100 ul 在 .5-1 x 106个细胞沾染血管中膜方面再中止，在沾染血管中膜 （PBS 包含 1% 商业软件联盟）方面洗细胞两次。 (6)污染细胞－增加抗体的最佳浓度而且抱为 1530 分钟的在 RT。 (7)在沾染血管中膜和圆球的 15 volumesof 中的洗细胞。 (8)在 stainging 血管中膜中再中止样品而且分析。 1.33 (1)脱蜡、水化。 (2)PBS洗两次各5分钟。 (3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。 (4)抗原修复。 (5)PBS洗5分钟。 (6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 (7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。 (8)PBS洗三次每次2分钟。 (9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。 (10)PBC洗3次每次2分钟。 (11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。 (12)PBS洗4次每次5分钟。 (13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色 （镜下掌握显色程度）。 (14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 (15)脱水、透明、封片、镜检。 1.4　统计学处理　 应用SPSS13.0统计软件包进行分析，数据以x±s表示，采用t检验对资料进行分析。以α=0.05作为检验水准。 2　结果 2.1CD、UC组淋巴细胞胞质均出现IL-17A阳性染 色，UC组阳性细胞主要存在于上皮的固有层淋巴细胞中，呈棕黄色，分布于腺体的周围，CD组的阳性细胞肠壁全层可见，在各层中的分布未见明显区别。正常对照组肠黏膜全层均未见阳性染色。 2.2　血清IL-17A、IL-10、IFN-γ蛋白的检测结果　 2.2.1　IL-17A蛋白　正常对照组血清中未检测到IL-17A，UC和CD组血清IL-17A水平明显升高，CD组平均水平较UC组高，但差异不大（P0.05）。 2.2.2　IL-10蛋白　CD组IL-10表达水平高于UC组及正常对照组P＜0.05，UC组与正常对照组相差不大P0.05。 2.2.3　IFN-γ蛋白　CD组、UC组血清中IFN-γ的水平与正常对照组比微升高，较差异小（P0.05）。 3　讨论 炎性肠病（IBD）是一类病因未明的胃肠道慢性复发性炎症性疾病，包括溃疡性 (ulcerative colitis UC)和克罗恩病(Crohn’S diseaseCD)。以再发的炎症或持续的慢性炎症为主要特征.在欧洲，其发病率为（100～150）/10万【2】，IBD发病高峰年龄在20～40岁【3】。 Th17细胞在IBD发生中