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5―Aza―CdR对胃癌细胞p16基因表达影响 　　摘要：目的： 探讨5-Aza-CdR对人胃癌细胞p16基因启动子甲基化以及mRNA表达的影响。方法： 体外培养人胃癌细胞株MKN-28，分别用0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L的5-Aza-CdR与之孵育72h。甲基化特异性PCR检测处理前后p16基因启动子甲基化水平。RT-PCR和Western blot检测p16 mRNA表达。结果： 随着药物浓度的增加，甲基化p16含量逐渐降低。而非甲基化p16逐渐增高。此外，5-Aza-CdR处理后，p16 mRNA和蛋白表达水平也随之增高。结论： 5-Aza-CdR可逆转MKN-28细胞株细胞中基因甲基化修饰状态，并上调其表达。 　　关键词：5-Aza-CdR；肝癌细胞；RASSFIA基因；启动子甲基化 　　资助项目：湖南省教育厅科技计划项目（13C963） 　　胃癌是一种恶性肿瘤，它严重危害着人们的身心健康，给胃癌患者带来了很大的身体危害及心理压力[1]。故本次研究利用5-Aza-CdR对体外培养的胃癌细胞株MKN-28的p16基因启动子区进行去甲基化反应，进一步探讨胃癌细胞中p16基因失活的机制以及5-Aza-CdR对其表达的调控作用。 　　1材料与方法 　　1.1主要试剂 　　5-Aza-CdR为Sigma产品，总RNA提取试剂为TRIzol，买自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒买自TaKaRa公司，RPMI1640培养基为Hyclone产品。 　　1.2细胞培养与处理 　　胃癌细胞株MKN-28接种于RPMI1640培养基，在37℃、含有50ml/LCO2 的湿润空气的恒温密闭式培养箱中进行培养。实验时细胞处于对数生长期，活细胞的数量要达到95%-100%。其中其培养瓶中加入含有不同浓度的5-Aza-CdR（0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L）进行孵育24、48、72小时，孵育结束后收集细胞，进行实验。 　　1.3甲基化特异性PCR 　　蛋白酶K-苯酚抽取法从细胞中抽取DNA，利用紫外分光光度计检测DNA的含量以及纯度，利用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性，重复测试3次。PCR反应条件为：特异性引物PCR的扩增条件为95℃下15min，95℃下40s，60℃下40s，72℃下40s，共进行35个循环，最后稳定在72℃下10 min。 　　1.4RNA提取与RT-PCR 　　将5-Aza-CdR处理的细胞收集起来，然后利用TRIzol试剂提取各组中MKN-28细胞的总RNA。PCR测试的反应条件为[2]：在95℃下进行预变性， 94℃下变性40s，58℃下复性40s，72℃下延伸1分钟，总进行35个循环，72℃下最后延伸6分钟。RT-PCR的产物利用琼脂糖胶进行分离，测试重复进行3次。 　　1.5Western blot检测p16蛋白表达 　　将5-Aza-CdR处理的细胞收集起来，将总蛋白进行提取，其蛋白的含量使用酚试剂法进行测定。以β-actin为内对照，利用条带密度值与内参照的密度值进行比较，分析结果，实验重复三次[2]。 　　1.6统计学分析 　　采用SPSS 15.0 统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差表示，多组比较采用one-way方差分析并行Student’s t检验，P0.05为差异具有统计学意义。 　　2结果 　　2.1不同浓度5-Aza-CdR下调胃癌细胞甲基化p16水平 　　MKN-28中p16呈现出异常甲基化状态，p16基因在0.5μmol/L 5-Aza-CdR处理的条件下甲基化条带减弱，在浓度为1.0μmol/L的时候出现非甲基化条带，仅有剩余部分呈现甲基化，随着浓度的进一步增加，非甲基化p16含量逐渐升高，最后呈现出完全去甲基化状态。 　　2.2不同浓度5-Aza-CdR上调胃癌细胞中p16 mRNA表达 　　5-Aza-CdR处理前的MKN-28中检测到的p16基因mRNA的表达较低，但是经过不同浓度的5-Aza-CdR处理以后，其中的mRNA的表达逐渐增强。以药物处理前的mRNA表达强度与对应的β-actin mRNA的表达强度的比值为基准，设为1，不同浓度药物的比值如表1。 　　表 1细胞株MKN-28在用药前后mRNA的表达 　　注：与处理前相比，p0.05。 　　2.3 5-Aza-CdR作用不同时间上调p16 mRNA表达 　　用5-Aza-CdR处理的MKN-28中检测到的mRNA的表达情况随着时间的增长，其上调的幅度越大。以mRNA表达强度与对应的β-actin mRNA的表达强度的比值为基准，设为1，不同浓度处理不同时间以后与处理前的比值如表2。 　　表 2细胞株MKN-28在用药前后mR