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g柑原生质体培养过程中羟自由基和总活性氧水平分析 　　摘要：以?崭逃?伤组织和试管苗为材料，通过酶解分离原生质体，于液体培养和观察；采用羟自由基测定试剂盒和电子顺磁共振技术分析羟自由基变化，通过流式细胞仪检测总活性氧水平变化。结果发现，培养的前3 d，愈伤组织原生质体羟自由基和总活性氧水平下降，而叶肉原生质体则升高；培养的后3 d，除愈伤组织原生质体羟自由基水平升高外，其他都下降。?崭桃度庠?生质体可能由于氧化胁迫引起死亡，而愈伤组织原生质体能较好地控制总活性氧水平从而顺利进入再生，另外培养6 d时其羟自由基含量的升高可能与细胞壁再生等有关。 　　关键词：?崭蹋辉?生质体；羟自由基；活性氧 　　中图分类号： S666.104+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0196-03 　　原生质体指采用机械法或酶解法去除细胞壁的裸露细胞，是研究植物生命理论基础问题的理想体系，还可对其进行各种细胞及遗传操作。因此，原生质体技术已广泛地用于植物体细胞杂交、遗传转化、种质资源保存、基因瞬时表达等方面。在柑橘植物上，原生质体培养及体细胞杂交技术为其遗传育种工作开辟了一条新思路，它已成为柑橘砧木及接穗品种改良的重要手段[1-2]。目前，柑橘原生质体主要从愈伤组织和叶片分离得来，但只有愈伤组织分离的原生质体可再生成植株，而叶肉原生质体目前尚不可分裂再生，还不能用于柑橘遗传改良[3-4]。迄今，这2种类型原生质体再生能力差异的机制尚不清楚。 　　虽然原生质体再生能力差异普遍存在于植物、基因型、外植体之间，但是这种现象的相关研究进展缓慢。直至20世纪90年代，有学者发现活性氧在原生质体分离中大量产生[5-7]，然而在原生质体培养阶段，不同再生能力的原生质体活性氧含量虽然都表现出下降的趋势，但是不可再生型原生质体活性氧水平相对较高[8-9]。上述研究表明，氧化胁迫可能是造成不可再生型原生质体再生难的原因。为此，笔者所在课题组以氧化胁迫为切入点开展了柑橘原生质体再生能力差异的研究[10-11]，重点对总活性氧水平及活性氧另一种重要成分（羟自由基）进行检测，以期了解活性氧在柑橘原生质体再生中的作用。 　　1材料与方法 　　1.1植物材料 　　?崭蹋?Citrus reticulata）胚性愈伤组织用悬浮培养基（MT+0.5 mg/L ME+1.5 mg/L谷胺酰氨+50 g/L蔗糖）悬浮培养4代后用于原生质体分离；取新鲜?崭坦?实，挑选出大粒种子，经消毒后接种于MT培养基上，大约培养30～40 d，叶片充分展开后用于原生质体分离。 　　1.2?崭淘?生质体分离与培养 　　原生质体的分离与纯化参照Xu等的方法[10]，稍作修改。 　　愈伤组织原生质体的分离：取3 g愈伤组织于培养皿中，分别加入2 mL的0.7 mol/L EME培养基（MT+0.7 mol/L蔗糖+0.5 g/L ME）和酶液（2%纤维素酶R-10+2%离析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaCl2?2H2O）。封口膜封口，28 ℃暗条件下酶解 18～20 h。 　　叶肉原生质体的分离：用手术刀片将试管苗叶片切成 1～2 mm 宽的条状，之后放入预先加入2 mL 0.6 mol/L EME（MT+0.6 mol/L蔗糖+0.5 g/LME）培养基中，最后加入 2 mL 酶液（2% 纤维素酶R-10+2%离析酶R-10+10.9%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaCl2?2H2O）。封口膜封口，28 ℃暗条件下酶解20～24 h。 　　酶解完成后的原生质体（酶解混合物）通过孔径为 45 μm 的不锈钢筛网过滤，并用CPW13洗涤、离心。然后采用CPW13/CPW26界面梯度离心，用吸管将2个液面间的原生质体带吸出。最后将原生质体悬浮于液体培养基MA（MT+0.15 mol/L蔗糖+0.45 mol/L甘露醇+40 mg/L腺嘌呤）中，封口转入28 ℃恒温培养箱培养。 　　1.3?崭淘?生质体培养过程中羟自由基含量变化的测定 　　分别采用羟自由基测定试剂盒和电子顺磁共振（EPR）仪方法测定。 　　羟自由基测定试剂盒测定方法：参照南京建成生物科技有限公司的羟自由基测定试剂盒说明书进行。试验重复3次，数据采用软件SPSS 17.0进行分析。 　　电子顺磁共振仪测定方法：首先收集原生质体悬液，离心弃上清，用CPW13清洗2次，再用CPW13重悬原生质体，最后将90 μL原生质体悬液与30 μL浓度为200 mmol/L的二甲基吡啶N-氧化物（DMPO）溶液充分混匀后，采用电子顺磁共振仪（Brucker ESP300）记录捕获羟自由基的电子