rRNA扩增直接检测艾滋和结核共感染结核分枝杆菌初步研究.docVIP

rRNA扩增直接检测艾滋和结核共感染结核分枝杆菌初步研究 　　作者单位：650041 昆明市第三人民医院 　　通讯作者：汪亚玲 　　【摘要】 目的 建立一种快速、准确、简便的检测结核分枝杆菌的方法。方法 应用间接转录扩增技术，以结核分枝杆菌特异性rRNA为扩增目标，扩增片段被特异性DNA探针结合（杂交），再经杂交保护分析法筛选，最后以化学发光仪检测被标记的rRNA。用该法检测62例临床标本。结果 62 例艾滋合并结核患者痰标本检出阳性9例。结论 rRNA扩增直接检测结核分枝杆菌方法作为结核病诊断的一项新的分子生物学检测方法，具有重要的临床应用价值。 　　【关键词】 结核分枝杆菌； rRNA 　　 　　近年来，结核病已经成为艾滋病患者主要机会性感染，HIV 和结核分枝杆菌（MTB）双重感染年递增率为10%，其发生结核病的概率HIV 阴性者比MTB阳性者高30倍［1］。合并感染后，病情进展迅速，是致死的主要原因。全球每年有400万人死于HIV和结核的双重感染，艾滋病合并结核的流行较为严重。但由于艾滋病患者合并结核感染固有的特点，给诊断及治疗带来很大困难。为满足临床迫切需要一种更快、更准确地早期诊断结核病的方法，以保证及早、更合理地进行治疗，本研究引进了美国Gen-Probe公司rRNA扩增结核分枝杆菌直接检测（MTD）技术［2］，首次在国内应用于HIV/AIDS合并结核分枝杆菌感染患者中结核杆菌的检测，并与传统的涂片抗酸染色和TB-PCR法、BACTEC MGIT960培养法进行平行观察，以比较其优劣，探讨该法的临床应用价值。 　　 　　1 材料和方法 　　1.1 样本来源及分组 本研究分析的均为临床确诊病例。主要选择2009年5月～2010年6月本院感染科住院的62例艾滋病患者的痰标本，男47例，女15例；年龄11～73岁，平均41岁，HIV感染诊断标准参照2005年我国卫生部发布的《艾滋病诊疗指南》诊断标准。 　　1.2 主要仪器及试剂 水浴超声仪、95 ℃干浴仪、42 ℃干浴仪、60 ℃干浴仪及LEADER 50 化学发光检测仪等均为美国Gen-Probe公司商品。MTD试剂盒、检测试剂和阳、阴性质控物等均为美国Gen-Probe公司商品。 　　1.3 MTD操作方法 痰标本中加入3% N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠（NALC-NaOH） （1：325），用振荡器振荡消化15 min；将痰液转入50 ml离心管，加pH 6.8磷酸盐缓冲液（ PBS）至45 ml刻度；3000 g离心15 min；沉淀物加pH 6.8 PBS 1 ml待用。 　　1.4 rRNA扩增MTD 严格按MTD试剂盒说明书的要求进行操作,其主要反应步骤:（1）裂解细菌释放Rrna:500μl前处理沉淀物悬液加入裂解管，于水浴超声仪中超声15 min。（2）溶解产物:样品裂解产物、阳、阴性质控物各25 μl分别加入预置有扩增试剂50 μl及甘油200 μl的扩增管；于95 ℃干浴仪中15 min。（3）扩增：各扩增管于42 ℃干浴仪中预温5 min后，加入25 μl酶试剂混匀后继续扩增30 min。（4）杂交：各管加入100 μl杂交试剂混匀后，于60 ℃干浴仪中15 min。（5）筛选：各管加入300 μl筛选试剂混匀后于60 ℃干浴仪中15 min，取出置室温5 min后检测。（6）检测：用LEADER 50 min化学发光检测仪检测样品光值（RLU），样品被检测的同时rRNA也被淬灭。（7）结果判断：临界值：30 000 RLU； RLU≥30 000阳性，500 000，阴性质控RLU20 000，方可报告。 　　1.5 其他平行检测方法 每份样品的前处理沉淀物均以常规方法平行作涂片抗酸染色、BACTEC MGIT960培养法和实时荧光定量PCR（TB-DNA），TB PCR 荧光检测试剂盒，TB 阳性定量参考品，购于中山大学达安基因股份有限公司；DA7600 型实时荧光定量PCR 仪为中山大学达安基因股份有限公司生产。 　　 　　2 结果 　　45例HIV感染者MTD、涂片、TB-PCR和培养法的平行检测 结果见表1～3。 　　表1 62例HIV感染者MTD和涂片的平行检测结果 　　 　　表2 62例HIV感染者MTD和TB PCR的平行检测结果 　　 　　表3 62例HIV感染者MTD和培养法的平行检测结果 　　 　　3 讨论 　　目前，我国已进入艾滋病快速增长期，同时我国也是全球结核病高负担国家之一。结核病是艾滋病最常见的最先发生的机会性感染之一。艾滋病合并结核病感染已成为严重的公共卫生问题，WHO 认为艾滋病和结核病不应再被看作两个独立的疾病。结核菌感染后，主要的病理及临床表现为结核杆