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ICA―HPLC检测枸杞中赭曲霉毒素A提取方法比较 　　摘要：对免疫亲和柱-高效液相色谱法（ICA-HPLC）测定枸杞中赭曲霉毒素A（OTA）的提取方法进行研究。对4种提取液[0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇 ∶ 水（1 ∶ 10 ∶ 4），0.1 mol/L 正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10），甲醇 ∶ 水（4 ∶ 1），2% NaHCO3 ∶ 15% NaCl（1 ∶ 1）]提取下枸杞干果中OTA含量的回收率进行对比和差异性分析，对最佳方法做准确度和精密度试验，并用此方法检测宁夏市场枸杞OTA污染情况。结果显示，0.1 mol/L 正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）为最佳提取液，回收率为615%～77.19%，变异系数为2.22%～2.83%；以0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇（5 ∶ 50）为提取液、ICA-HPLC法测定枸杞干果中OTA方法稳定、可靠；宁夏市场枸杞OTA检测结果显示不存在污染。 　　关键词：宁夏枸杞；赭曲霉毒素A；免疫亲和柱；高效液相色谱法 　　中图分类号： S567.1+90.1；R284.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0347-03 　　赭曲霉毒素A（OTA）是一类真菌毒素，主要由赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和纯绿青霉（Penicillium viridicatum）产生的有毒代谢产物，对人及多种动物具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性，国际癌症研究机构IARC将其确定为2B类致癌物[1-4]。OTA污染范围较广，可污染粮食谷物、蔬果、干果、调味剂、啤酒、葡萄酒及中草药材等，严重影响人们的农业生产和食品安全[5]。 　　宁夏拘杞已有600多年的栽培历史，全区枸杞种植面积2.97万hm2，枸杞产品种类主要有枸杞干果、枸杞鲜果、枸杞鲜汁、枸杞粉、枸杞酒等[6]。由于枸杞具有多糖、含水率高、表皮有蜡质层等特性，使得枸杞鲜果制干时间较长，致使其易发生霉变。研究表明，一般情况下，采摘后的枸杞鲜果不经任何处理，3 d后霉变可高达50%～80%，严重影响枸杞干果的产量和质量[7-8]。目前，关于 OTA 纯化和测定方法的研究已经较为深入，但现有的提取方法很多，不同样品提取方法不尽相同，目前枸杞干果中OTA的研究未见报道，因此建立一种枸杞干果中OTA的提取方法具有重要意义。 　　本研究采用有机溶剂和碳酸氢钠等溶液为提取液提取枸杞干果中的OTA，从回收率、精密度、准确度等角度进行分析，找出一种简便高效的提取枸杞干果中OTA的方法，为宁夏枸杞安全生产提供科学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器 　　固相萃取装置（美国Varian）；CY-200电动粉碎机（台州市新恩精密量仪器有限公司）；赭曲霉毒素免疫亲和柱 IC CF-04 （北京泰乐祺科技有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1200Series，美国 Agilent）；荧光检测器（Agilent Technologies 1200Series，美国 Agilent）；反相C18柱（pH值2～12，美国 Agilent）；Empower Software色谱数据处理系统（美国 Agilent）；微量移液枪（德国Eppendorf）。 　　1.2 试剂 　　OTA 标准品（纯度99 %，Fermentek公司）；乙腈和甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；其他试剂均为化学纯。 　　OTA 标准储备液的配制：1 mg OTA 标准品用甲醇完全溶解，定容至50 mL（浓度20 μg/mL，-20 ℃避光保存）。 　　OTA 标准工作液的配制：取2.5 mL OTA 标准储备液，用甲醇定容至50 mL（浓度1 μg/mL，4 ℃避光保存）。 　　样品：宁夏枸杞干果购自银川市同心路枸杞批发市场。 　　1.3 方法 　　样品准备（粉碎、称量、加标）→提取→免疫亲和柱净化→高效液相色谱仪检测。 　　1.3.1 提取 用粉碎机将干燥后的枸杞干果粉碎，取粉碎后的枸杞样品25 g，分别加入100 mL 0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇 ∶ 水（1 ∶ 10 ∶ 4）[9-10]、0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）[11-12]、甲醇 ∶ 水（4 ∶ 1）[13，15]、2% NaHCO3 ∶ 15% NaCl（1 ∶ 1）[16-19]等4种提取液，高速搅拌3min，15 000 r/min离心10 min，上清液用1.2 μm滤膜过滤，取15 mL滤液用001 mol/L PBS稀释定容至100 mL，即为OTA提取液。 　　1.3.2 净化 免疫亲和柱净化方法参照孙林超等的方法[14-15]，并适当修改：（1）I