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PIN2蛋白在水稻根尖细胞中定位方法优化 　　摘要：PIN2蛋白作为生长素外排蛋白，在植物根的向地性生长中起重要作用。免疫定位法是一种可以将蛋白在植物细胞中快速准确定位的方法。本研究利用改良的免疫荧光定位法，对PIN2蛋白在水稻根尖细胞中的定位进行了观察，并与前人的两种方法进行比较。结果表明，与已有的方案比较，改良免疫荧光定位法可使PIN2蛋白在水稻根尖细胞中的位置快速准确地被观察到，且简化了操作步骤，操作方便快速，可广泛应用于植物其他蛋白的定位研究。 　　关键词：PIN2蛋白；免疫荧光定位；水稻；根尖细胞 　　中图分类号：S511+S188+.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）08-0104-03 　　Abstract PIN2 as an auxin efflux protein plays important roles in geotropic growth of plant roots. Immunolocalization technique is a method which allows rapid and reliable in situ localization of proteins in plant cells. In this paper， the improved immunolocalization technique was used to localize the PIN2 in root tip cells of rice， and its effect was compared to the two existing methods. The results showed that the location of PIN2 could be more quickly and accurately determined in root tip cells of rice by the improved method； and the improved method simplified the operation procedures and was more convenient， so it could be used for the localization researches of other plant proteins in the future. 　　Key words PIN2 protein； Immunolocalization； Rice； Cells of root tips 　　PIN蛋白家族定位于细胞膜，而这种极性定位决定了生长素的极性流向及梯度分布[1～3]，植物通过维持PIN蛋白在内吞循环途径及液泡降解与储存途径间的动态平衡，控制生长素的极性运输效率[4，5]。生长素极性运输在植物胚胎、侧生器官的发生与发育、向性生长中起了关键性的调控作用，已成为植物发育生物学领域中的研究热点之一[6]。PIN2蛋白属于生长素的外排蛋白，在植物根尖表皮层及真皮层细胞中表达，主要在植物根向地性生长中起作用[7]。植物根系的向地性决定着根系空间生长的趋势，对植物养分的吸收 （特别是磷的吸收）具有着重要的影响[8]。因此，深入研究植物根系向地性的分子机制及PIN2蛋白在植物根系中的定位对于植物根系遗传改良具有实践和理论的指导意义。 　　蛋白质的功能、相互联系或活性的研究需要一种在细胞及亚细胞水平对蛋白定位的可靠分析方法。Brandizzi等[9]采用DNA与荧光蛋白重组技术研究了活体内蛋白的亚细胞定位，其缺点为重组的蛋白质分子特性已改变，可能不会精确定位，基于蛋白抗体的免疫定位则克服了这一缺陷。Lauber[10]和Friml等[11]提出了适于小段组织蛋白免疫定位的方案；Sauer等[12]在他们的方法上进行了改进，使其更加省时、简便、可自动化。目前，免疫定位技术被广泛应用于拟南芥、烟草、马铃薯等植物的研究中，而水稻根尖组织中蛋白的免疫定位尚未见报道。由于水稻细胞壁拥有“角质-双硅层”结构，降低了细胞的相对透性[13]，对蛋白免疫定位有较大的干扰。本研究在Friml和Michael的方法上进一步对实验试剂、承载体及操作步骤进行了优化，采用改进的免疫荧光方法，以水稻根尖组织作为供试材料，观察了PIN2蛋白的定位，并与Friml和Sauer的方法进行分析比较，力求寻找一种简便快速、可用于水稻根尖细胞中蛋白精确定位的方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　供试材料为野生型水稻LTH，由云南农业大学植物病理重点实验室提供。 　　1.2 仪器及试剂 　　仪器：96孔板，载玻片，真空泵，激光共聚焦显微镜（Leica confo