PEG处理对种子线粒体中抗坏血酸―谷胱甘肽循环影响.docVIP

PEG处理对种子线粒体中抗坏血酸―谷胱甘肽循环影响 　　摘要选用对吸胀冷害敏感的大豆品种[Glycine max（L.）Merr.]中黄22为试材，PEG引发处理不同时间，于恒温培养箱培养48h后提取种子子叶中的线粒体，不连续蔗糖梯度离心纯化后，测定线粒体中抗氧化酶和抗氧化剂的变化情况。结果表明：PEG引发处理后大豆种子发芽指数、活力指数均提高，种子线粒体中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase APX）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase GR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase MDHAR）和脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase DHAR）的活性均提高，还原型抗坏血酸（ascorbate ASC）/脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate DHA）和还原型谷胱甘肽（glutathione GSH）/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione GSSG）值增加。说明PEG引发处理增强了种子活力，提高了大豆种子抗吸胀冷害的能力。 　　关键词大豆种子；PEG；线粒体；抗氧化还原系统 　　中图分类号Q945.6+5文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）06-0135-02 　　 　　许多栽培植物的种子在吸水萌动的初始阶段，如遇上低温易发生吸胀冷害，影响种子的出苗率和成活率，使幼苗的生长势下降，最终导致产量下降[1，2]。最早由Heydecker等提出通过种子引发来克服农业生产上遇到的种子冷害问题，且已证实具有显著作用。陶宗娅等认为发生吸胀冷害的要害是阻碍线粒体的正常发育，使其失去正常提供能量的功能[2，3]。同时Ana Jimenez等证实了线粒体中ASC-GSH的存在，以及ASC-GSH在非生物胁迫下的抗氧化胁迫作用[5，6]，说明该系统在抗性方面具有重要作用。因此，本文通过PEG引发处理后种子线粒体中抗氧化系统的变化与种子抗吸胀冷害能力的关系，以探讨其可能的耐寒机理，并为农业生产提供理论依据。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1试验材料 　　试验以大豆[Glycine max（L.）Merr．]品种中黄22种子为试材，由中国农业科学院大豆研究所提供。 　　1.2材料的处理 　　1.2.1发芽试验。将种子置于33%（W／V）PEG 6 000水溶液中，于25℃ 渗控不同时间（0h、12h、24h、48h、72h）后，同时置于4℃冰水中低温吸胀24h，随即进行发芽试验（25℃），检测PEG渗控对大豆种子抗吸胀冷害能力的影响。 　　1.2.2线粒体的提取。将种子进行同样的处理，于恒温培养箱培养48h后提取种子子叶中的线粒体，对线粒体中ASC-GSH抗氧化还原系统的成分进行测定，试验重复3次。 　　1.3种子发芽率及活力测定 　　发芽试验按《国际种子检验规程》（1996）进行，发芽床为12 cm培养皿加双层滤纸，用水湿润，每皿放25粒种子，3次重复。在HPG-280H人工气候箱内发芽，温度为25℃ ，光强为80μmoL/m2，记录发芽率及胚根干重。统计7d时的发芽率，发芽指数（GI）与活力指数（VI）按下式计算：GI=ΣGt／Dt；VI=GI×Sx。其中Gt为7d内种子每天的发芽个数，Dt为发芽天数，Sx为发芽7d时25粒种子胚根的总平均干物重。 　　1.4线粒体的提取及纯化 　　1.4.1提取[7]。大豆种子置于33%（W／V）PEG 6 000水溶液中，于25℃渗控不同时间（0h、12h、24h、48h、72h），并同时置于4℃冰水中低温吸胀24h，放于HPG-280H人工气候箱内培养48h后，取20g大豆种子子叶，将子叶放在盛有约35mL研磨介质中研磨成糊状。研磨介质的成分为：0.4mol/L蔗糖、50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH值8.0）、1mmol/L EDTA-Na2、0.1% BSA、1% PVP。匀浆用4层纱布过滤，滤液于1 000g离心10min，取其上清液10 000g离心15min，沉淀用20mL研磨介质洗涤，在10 000g下再次离心15min，将沉淀悬浮于1mL悬浮介质中即得到粗制线粒体悬浮液。悬浮介质的成分为：0.4mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH值7.2）、1mmol/L EDTA-Na2、0.6% BSA。所有操作均在4℃下进行。 　　1.4.2纯化[7]。配制蔗糖梯度溶液，按由高到低的顺序将60%、52%、36%、20%的蔗糖溶液，依次铺入12mL透明管中室温放置1h后，将2mL粗制线粒