LC―MSMS 法测定乌苯美司及甲氨蝶呤在临床药物相互作用中应用.docVIP

LC―MSMS 法测定乌苯美司及甲氨蝶呤在临床药物相互作用中应用 　　[摘要] 目的 建立灵敏、高效、专属性强的高效液相色谱质谱联用法用于测定生物样品中乌苯美司和甲氨蝶呤的浓度。 方法 两种LC-MS/MS法均采用乙腈沉淀蛋白法处理生物样品，应用Hypersil ODS-C18色谱柱分离，通过电喷雾电离源串联质谱，以多反应监测方式进行负离子检测，测定生物样品中乌苯美司和甲氨蝶呤的浓度。其中，m/z 309.10 →m/z 120.30，m/z 455.20→m/z 308.20和m/z 370.40→m/z 288.10分别作为乌苯美司、甲氨蝶呤和西洛他唑（内标）定量分析时监测的离子对，色谱分离的流动相为乙腈-0.1%甲酸水（60∶40，=v/v），流速为0.4 mL/min。结果 苯美司、甲氨蝶呤在2.00～2000.00 ng/mL的范围内线性关系良好（r2=0.9976）。 结论 所建的LC-MS/MS法快速、灵敏、专属性强，适用于乌苯美司和甲氨蝶呤临床药代动力学研究。 　　[关键词] 乌苯美司；甲氨蝶呤；药物相互作用；液相色谱质谱联用 　　[中图分类号] R927.2；R961 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）30-0144-05 　　肿瘤是一类严重危害人类健康的多发病、常见病。化疗在癌症综合治疗中处于不可缺少的重要地位，为了提高化疗的疗效，医学工作者开展了多方面的研究，如开发新的高效低毒的药物，更科学合理联合用药以协同增效等。其中，联合用药是临床上长期使用且合理有效的治疗手段，所以药物相互作用（drug-drug-interaction，DDI）是长期困扰临床治疗的问题之一[1]。P-糖蛋白（P-gp）影响药物代谢动力学及口服生物利用度，临床上许多的癌症化疗药物是P-糖蛋白的底物，都被它所外排[2，3]。有机阴离子转运体（organic anion transporter，OATs）将血液中的有机阴离子转运至肾小管上皮细胞内，OATs能够转运一些内源性阴离子代谢物及某些有机阴离子药物[4-6]。甲氨蝶呤（MTX）是治疗肿瘤和一些自身免疫性疾病的有效的抗癌药物。近些年来有报告指出，甲氨蝶呤的多药耐药与药物相互作用常?cP-gp和OATs有关[7-9]。乌苯美司（bestatin）是临床上常用的一种免疫增强剂，用于配合其它化疗药物的治疗。当甲氨蝶呤与乌苯美司合用时，这些转运体是否影响二者体内动态和临床疗效也不明确[10-12]。因此，本实验目的是建立灵敏、高效的LC-MS/MS检测方法阐明甲氨蝶呤和乌苯美司相互作用分子药代学机制。 　　1 仪器与试剂 　　1.1 仪器 　　Agilent HP1200 液相色谱系统（美国Agilent公司）API 3200 型三重四级杆质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；FCR 2002-UF型纯水机（德国FLOM公司）；HSC-24B型氮气吹干仪（中国天津恒奥科技有限公司）；ST-16R型高速离心机（德国Thermo公司）；AL104万分之一电子天平（梅特勒仪托利多公司）。 　　1.2 试剂 　　乌苯美司对照品（深圳万乐药业有限公司，批号：H2006 7632，纯度99.0%）；甲氨蝶呤对照品（美国sigma公司，批号：119H1449，纯度99.0%）；西洛他唑原料药（IS， 浙江金立源药业有限公司，批号：纯度99.0%）；甲醇为色谱纯（美国Tedia公司），其他试剂均为分析纯。 　　1.3 研究对象 　　健康幼年雄性Wistar大鼠，体重220～250 g由大连医科大学SPF实验动物中心提供，洁净级，许可证号：SCXK（辽）2008-0002。OAT1和OAT3细胞由中科院上海药物所宫丽琨教授友情提供。MDR1-MDCK细胞由浙江大学曾苏教授友情提供。K562、K562/ADR细胞购自凯基生物。 　　2 方法与结果 　　2.1主要溶液的配制 　　2.1.1 对照品溶液的配制 分别精密称取乌苯美司和甲氨蝶呤标准品10.1 mg，用甲醇∶水（50∶50，v/v）溶液精确定容于10 mL容量瓶中得到1.00 mg/mL的储备液I及2.00、5.00、20.00、50.00、200.00、500.00和2000.00 ng/mL标准系列浓度的标准品溶液；配制出低、中、高三个不同浓度的质量控制样品（其QC浓度分别为4.00、50.00和1000.00 ng/mL）。储备液I以及标准系列溶液均置于4℃保存，并于使用前放置至室温。 　　2.1.2 西洛他唑内标溶液的配制 精密称取西洛他唑标准品10.1 mg，用甲醇∶水（50∶50，v/v）溶液精确定容于10 mL容量瓶中得到1.00 mg/m