LC―MSMS法测定人血浆中多粘菌素E浓度分析方法建立.docVIP

LC―MSMS法测定人血浆中多粘菌素E浓度分析方法建立 　　【摘要】目的：建立人血浆中多粘菌素E浓度测定的LC-MS/MS方法，方法：样品处理：蛋白沉淀；采用Agilent Polaris C18（50 * 3 mm， 3 μm）色谱柱；流动相05%甲酸水溶液（A）-05%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱；流速为065 -24mL/min；内标物：多粘菌素B1；质谱检测，正离子模式。结果：多粘菌素E1的线性范围是200～2000 ng/mL（r2=09984），定量下限为200 ng/mL。批内精密度≤42%，批间精密度≤37%；提取回收率在1003%-1135%之间，总体变异系数（%CV）为62%。本方法定量下限低，血浆前处理方法操作简便，节约成本。结论：建立的方法准确精密、稳定可靠，可用于人血浆中多粘菌素E1浓度的检测。 　　【关键词】 多粘菌素E；LC-MS/MS；蛋白沉淀 　　【中图分类号】 　　R764.04【文献标志码】 　　B【文章编号】1005-0019（2018）06-220-01 　　多粘菌素是从多粘杆菌培养液中分离出的一种含多种组分的碱性多肽类抗生素，其结构是由环状多肽和脂肪酸结合而成，可分为多粘菌素A、B、C、D、E、K、M和P共8种。其中多粘菌素E在该类抗生素中毒副作用小，在临床上应用较多[1]。多粘菌素E是一种由至少30种不同的成分组成的复杂混合物[2]，其主要成分是多粘菌素E1（colistin A）和少量多粘菌素E2（colistin B）。多粘菌素E对革兰氏阴性菌引起的感染有较强作用，抗菌谱主要为大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、嗜血杆菌和铜绿假单胞菌等病原菌，并且这些细菌对氨基糖苷类，β内酰胺类和氟喹诺酮类等常用抗菌药物的耐药性相当普遍，许多菌更是多重耐药[3]，但是多粘菌素E不易产生耐药性。上世纪70年代多粘菌素因其肾毒性和神经毒性一度被弃用，然而多重耐药革兰氏阴性菌的出现促使多粘菌素重新成为人们治疗革兰氏阴性菌的重要选择，再度被应用于临床[4]，EVANS等人为：多粘菌素E是治疗多重耐药性革兰氏阴性菌感染重要而又有效的手段[5]。目前对多粘菌素E的分析方法主要有HPLC法，MECC法和LC-MS/MS法，由于多粘菌素E的紫外吸收低，因而应用传统HPLC法（紫外检测器）分析对检测器灵敏度要求较高。LC-MS/MS法广泛应用于多粘菌素E的药代动力学、临床检测等领域，在药动学研究中使用该方法需要选择较好的生物样品前处理方法，本研究采用蛋白沉淀样品的前处理方式，建立了血浆中多粘菌素E的LC-MS/MS检测方法，简化了血浆预处理过程，对色谱条件进行优化，为人血浆样品中多粘菌素E浓度的测定提供了更简便易操作和节约成本的方法。 　　1仪器与材料 　　11仪器质谱仪API5000（美国Applied Biosystem公司）；岛津高效液相色谱（DGU-20A5在线真空脱气机；LC-20AD液相泵；SIL-20ACXR自动进样器；CBM-20A控制器构成，日本岛津公司）；微量分析天平（XP6，梅特勒-托利多）；高速台式冷冻离心机（5810R，eppendorf）；涡旋震荡仪（M37610-33CN，Thermo）；超纯水系统（Millipore） 　　12材料多粘菌素E?俗计罚ㄅ?号1304FP0708 ，Sigma）；多粘菌素B1标准品（内标，批号：0248069-6，Cayman）；甲酸（色谱纯，sigma）；乙腈（色谱纯，sigma）；甲醇（色谱纯，sigma）；去离子水（Millipore） 　　2方法 　　21色谱条件色谱柱Agilent Polaris C18（50 * 3 mm， 3 μm）；流动相：流动相A为05%甲酸水溶液，流动相B为05%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱见下表；进样量10μL。 　　22质谱条件ESI：正离子模式；喷雾电压：2000V；去簇电压：90V；碰撞能量：45V；多粘菌素E1离子对5856→1011；多粘菌素B1离子对6025→2413 　　23血浆样品处理移取100 μL 血浆样品于96深孔板中，加入100 μL稀释液至样品中，加入50 μL 浓度为3000ng/mL 的内标工作液，加入400μL纯水，涡旋使之混匀，加入400μL甲醇，800转涡旋约1分钟，于每分钟3500转，室温下离心10分钟，移取400μL纯水于新的96孔板中，转移200μL上清液至该96孔板中，封板后1000转涡旋约1分钟，于每分钟3500转，室温下离心5分钟，取上清液100μL进样分析。 　　24线性范围使用不同浓度的标准曲线工作溶液与空白血浆配制出浓度分别为200、400、100、200、400、800、1600和2000 ng/mL的多粘菌素E1血浆样品，按照23项下处