n6脂肪酸去饱和酶fat1基因对神经元细胞凋亡抑制作用.docVIP

n6脂肪酸去饱和酶fat1基因对神经元细胞凋亡抑制作用 　　摘　要：将C.elegans n-6脂肪酸去饱和酶基因fat-1的cDNA插入到腺病毒的穿梭载体pAd-CMV中，并与骨架载体同源重组，构建腺病毒重?载体(Ad.GFP.fat1)，通过包装细胞系(293)产生重组腺病毒，感染原代培养的大鼠皮层细胞，在显微镜下观察、细胞增殖试剂盒(MTT)和凋亡染色试剂盒分析fat-1基因对大鼠皮层细胞凋亡的影响，核糖核酸酶保护性分析，检测fat-1基因在大鼠皮层细胞内的表达，酶联免疫分析花生四烯酸类(Eicosanoids)前列腺素(ProstaRlandin E2)的含量，结果表明，通过基因重组技术，得到预期的重组病毒；fat-1基因在原代培养的大鼠皮层细胞中能有效异源表达，2d后，可检测到fat-1mRNA的条带，与对照Ad.GFP细胞相比，fat-1基因明显抑制了大鼠皮层细胞因诱导产生的凋亡(35％)，受保护细胞的前列腺素含量也明显地减少(30％)。 　　关键词：神经元细胞；凋亡；多不饱和脂肪酸；基因治疗 　　中图分类号：Q735；R741.5　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0227－06 　　 　　哺乳动物的大脑富含长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAS)，尤其是花生四烯酸(AA，20:4n-6)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6n-3)，许多研究已经表明DHA在大脑发育和突触形成时是不可缺少的，是神经元发挥正常功能的必需物质，人类低血压、癫痫发作、精神运动性阻滞、耳聋和视网膜病，都是与n-3 PUFA缺乏有关的几种特征性疾病。 　　在发育过程中，神经元细胞凋亡是常常发生的，它对神经系统的形成是至关重要的，然而，这种生理性细胞死亡的形式也与许多神经退行性疾病有关，如早老性痴呆和帕金森病，由于n-3PUFAs对正常大脑发育和功能的重要性，一些研究表明，补充DHA可促进大鼠视网膜感官器的存活，以及体外培养的神经2A和PC-12细胞的存活，而且，注射n-3脂肪酸可以防止短暂性缺血动物模型的神经元细胞死亡，还可防止?痫发作引发的兴奋毒素性细胞死亡。 　　补充外源性脂肪酸是提高哺乳动物神经元n-3 PUFAs含量的唯一可能的方法，因为哺乳动物细胞既不能合成n-3 PUFAs的前体-ALA，也不能使n-6 PUFAs转变成n-3 PFAs，最近，我们发现利用C.elegans n-6脂肪酸去饱和酶(一种使n-6PUFAs转变为n-3 PUFAs的酶)的基因转移，可以增加细胞膜必需脂肪酸的组成，在本研究中，我们观察了n-6去饱和酶能否在皮质神经元中表达，以及这种酶的表达能否抑制诱导的神经元细胞的凋亡作用。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　重组体腺病毒的构建 　　携带fat-1基因的重组体腺病毒的构建依照Kang等的方法，含有n-6脂肪酸脱氢酶cDNA(fat-1基因)的质粒经EcoR V/Kvn I切割后，插入到pAdTrack-CMV载体中，并与腺病毒骨架载体pAdEasy 1在E.coli内进行同源重组，得到2个克隆：Ad.GFP，只携带绿荧光蛋白基因(GFP，作为报告基因)，用作对照病毒，和Ad.GFP.fatl，携带2个基因fat-1和GFP，通过酶切和DNA测序检测重组载体的正确性，重组的腺病毒载体DNA用Pac I消化，回收目的大片段后与SuperFect(QIAGEN)混合，转染293细胞，包装、繁殖、分离纯化病毒后即可用于感染原代培养的大鼠皮层细胞。 　　 　　1．2　组织培养和腺病毒转染 　　应用标准化技术制备大鼠皮质神经元，从怀孕17d的产前大鼠中分离出胚胎的皮质神经元，放置人赖氨酸包被的12孔培养板中培养，细胞浓度为每孔2×106个，细胞在神经培养基(NBM，Life Technologies，Grand Island，NY，USA)中生长，并含有25mmol/L谷氨酸(美国Sigma公司)、0.5mmol/L谷氨酰胺、1％抗细菌、抗霉菌溶液和2％B27(Life Technologies)，培养条件保持在37℃，5％CO2，相对湿度为98％，培养基每4d换一次，经过8～10d的培养，当细胞覆盖率在70％时，用Ad.GFP(对照组)或Ad.GFP.fatl感染细胞(直接把病毒颗粒加入到培养基中)，24h后换正常的培养液，48h后，进行紫外荧光显微拍照、基因表达、细胞增殖、凋亡和花生四烯酸类(前列腺素PGE2)的定量分析。 　　 　　1．3　RNA分析 　　使用RPAⅢ试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)通过核糖核酸酶保护性分析测定fat-1转录的mRNA，首先用总RNA分离试剂(TRIzol:Gibo公司)按说明书从培养细胞