福建省课件《基因工程和细胞工程》.pptVIP

细胞内DNA的合成途径 从头合成途径：以氨基酸和其他小分子起始合成核苷酸，进而合成DNA 的过程；可被叶酸类似物氨基蝶呤（A）阻断； 旁路合成途径：胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷（T）合成DNA；次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤（H）合成DNA。 在旁路合成途径中，HGPRT负责催化磷酸核糖焦磷酸和嘌呤基形成嘌呤单磷酸核苷酸，而TK可催化胸苷转化为5’-单磷酸胸苷，作为胸苷脱氧核苷酸合成的材料。 HAT选择培养基 含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培养基，是动物杂交细胞筛选中最常用的方法。在这种培养基中细胞只能利用旁路途径合成DNA，因而只有具有HGPRT+或/和TK+的细胞才能生长。 在HAT选择培养基中 骨髓瘤瘤细胞（HGPRT-或TK-）及其同核体：不能增殖，→死亡； B淋巴细胞及其同核体：体外培养条件下增殖次数有限， →死亡； 杂交瘤细胞： →存活 阳性细胞的筛选 将融合细胞充分稀释，进行克隆培养；然后再通过酶联免疫吸附测定( ELISA) ，筛选出能够分泌较高水平抗体的融合细胞，即阳性细胞，再进行克隆化培养。 杂交瘤细胞的克隆培养 有限稀释法：将稀释到一定密度的杂交瘤细胞接种到96孔培养板中，尽可能使每个孔中只有一个细胞生长； 软琼脂培养法 ：软琼脂的半固态性质，使单个的杂交瘤细胞在相对固定的位置上增殖形成细胞克隆。 一般情况下，杂交瘤细胞的染色体处于不稳定状态，因此当细胞分裂时，染色体分配不平衡，易造成杂交瘤细胞在分裂增殖过程中失去抗体分泌能力，所以克隆化培养3～5次后，才能获得稳定基因型和稳定分泌特异性抗体的细胞。 单克隆抗体的大量制备 体内法：将稳定的单克隆细胞注入到小鼠腹腔培养，然后从腹水中分离、提取单克隆抗体。 细胞培养：体外克隆培养，再从培养液中回收产生的抗体。 单克隆抗体的纯化 通过上述培养之后获得的培养液或腹水，其中除了单克隆抗体之外，还有无关的蛋白质等其他物质，因此必须对产品做分离纯化。目前，常用的方法有硫酸铵沉淀法、盐析法、离子交换、凝胶过滤或亲和层析等等。一般是综合采用几种方法分步进行纯化。 单克隆抗体的应用 1. 作为亲合层析的配体 单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。 2. 作为生物治疗的导向武器 将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将化疗药物或放疗物质携带至靶器官，可直接杀伤靶细胞。 另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。 治疗用脂质体 3.检验医学诊断试剂 单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术，目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：①病原微生物抗原、抗体的检测；②肿瘤抗原的检测；③免疫细胞及其亚群的检测；④激素测定；⑤细胞因子的测定。 4. 作为研究抗原的探针 例如前面讲的Western blotting。 5. 作为免疫抑制剂 抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。 * Study Guide Can you describe the major regions of an immunoglobulin molecule? What distinguishes the immunoglobulin classes from one another? What is shared between classes? What is the significance of the variable regions? What is the significance of the Fab, the Fc, disulfide linkages? 重链区：每条约有450-550个氨基酸残基，相对分子量50-70KD。根据重链分为5种。 轻链：每条214个氨基酸残基，相对分子量25KD。以二硫键相连。每个Ig分子的两条轻链