三碱性磷酸酶的分离纯化和Km测定.PPTVIP

第二部分 碱性磷酸酶Km测定 一、实验目的 掌握碱性磷酸酶的的动力学鉴定—Km鉴定 二、实验原理 当温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增 大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此 时反应速度为最大速度（Vmax）。Michaelis Menten 对酶促反应速度与作用物浓 度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于 1913 年提出了数学方程式，即著名的米一曼方程式： 作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为 1/Km，根据在横轴上的截 距，可以计算出该酶的 Km。本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷 酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与 4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧 化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。其反应式如下： 磷酸苯二钠 磷酸盐 + 酚 AKP 酚 + 4-氨基安替比林 红色醌类衍生物 铁氰化钾 PH 10 碱性 利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（A），按 Lieweaver-Burk 二氏法作图，从 x 轴上的截距求得其 Km 值。 三、实验仪器及试剂 仪器： 恒温水浴锅，721 型分光光度计。 试剂：1. 0.04mol/L 作用物液：称取 10.16g 磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2·2H2O），用 煮沸后冷却的蒸