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一种快速分离苹果果肉单细胞的方法 　　摘要：单细胞是生物体的基本单位，提取具有活性的单细胞是研究果实发育的基础。以苹果为材料，研究不同酶液组合和酶解时间对苹果果肉单细胞分离的影响。结果表明，苹果果肉在01%离析酶、暗酶解05 h时，为理想的苹果果肉单细胞分离条件。 　　关键词：苹果；单细胞；离析酶；酶解浓度；酶解时间 　　中图分类号： S661101文献标志码： 　　文章编号：1002-1302（2017）16-0138-02 　　[HJ14mm] 　　收稿日期：2016-03-29 　　基金项目：山东省现代农业产业技术体系项目。 　　作者简介：邢文曦（1990―），女，山西朔州人，硕士研究生，主要从事果树栽培与生理等研究。E-mail：kaoyanxixi@163com。 　　通信作者：刘成连，教授，研究方向为果树栽培生理与分子生物学。E-mail：fmdb@qaueducn。 　　单个活体细胞是生物生命活动的基本单元和进化的基本单位，对单个活体细胞的识别、分选及分析，能够解析生命体系最深层次的异质性和运作机制。同时，因其不依赖细胞的培养和扩增，单细胞技术在生物发育、生物能源、气候变化、疾病诊断、食品安全、农业生态等领域具有广阔的应用前景。分离植物精细胞用于离体培养，可以为通过离体有性繁殖途径进行植物品种改良打下基础；分离保卫细胞原生质体，使研究保卫细胞本身的生理生化特性及其与气孔功能的关系成为可能；分离维管束组织和韧皮部组织细胞，可以进行组织特异表达基因的鉴定。利用棉纤维单细胞研究细胞壁和纤维素的形成过程，能帮助人们更好地提高棉纤维的质量。目前，研究基因表达都是一群细胞的基因表达，这种表达实际上是每个细胞特异表达的平均情况，但是单个细胞的基因表达分析能够提供隐藏在群体细胞中单个细胞发育的新机制[3-4]。细胞膜上有各种离子通道，如钙离子通道、钾离子通道及钠离子通道等，这些通道调节离子进出，利用膜片钳技术可研究单个细胞离子通道的特性等，从而深入地研究生物体信号传导、细胞渗透压、细胞营养及抗逆性等各种生理机制。Li等利用膜片钳等技术，发现了控制钾离子通道的流向转换机制，揭开了使同一离子通道的离子流向发生逆转的关键因素[5]。果实的发育过程就是果肉细胞发育的过程，决定着果实的硬度、甜度、营养物质含量等，与果实贮藏时间长短、病害发生等都有关系，因此研究分离活性果肉单细胞是研究果实发育的基础；但是目前还没有果树类果肉细胞分离的相关报道，本研究以苹果为材料，研究果肉细胞的提取方法。 　　1材料与方法 　　11材料 　　从青岛农业大学教学实习基地，取成熟富士苹果，贮藏于4 ℃备用。 　　12器材与试剂 　　荧光显微镜 （LEICA，DM2500，德国）、匀浆机、低速离心机、恒温摇床、磁力搅拌器等。 　　13试验方法 　　131单细胞分离 　　配制细胞和原生质体洗涤溶液（cell and potoplast wash solution，简称CPW）：101000 mg/L KNO3，27200 mg/L KH2PO4，246000 mg/L MgSO4?7H2O，1 480000 mg/L CaCl2?2H2O，0160 mg/L KI，0025 mg/L CuSO4?5H2O，0400 mol/L 甘露醇，4 ℃低?乇４姹赣谩Ｏ宋?素酶、果胶酶、离析酶溶于CPW溶液中，酶液见表1。 　　将苹果表皮以下的果肉用手术刀切成边长05 cm 的小方块，再徒手切成薄片。将切好的苹果薄片分别置于50 mL的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶液中（酶液的组成见表1），于70 r/min摇床中振荡酶解05 、10、20 h（27 ℃，黑暗条件）。静置后，用CPW溶液清洗3次，以洗去酶液，再移到50 mL烧杯中，在磁力搅拌器上搅拌1 h后，在显微镜上检测，比较各个酶液在不同处理时间下获取单细胞的结果。 　　132采用VBL检测细胞壁完整性 　　采用黄祥辉等的方法，配制VBL[4，4′-bis（4-anilino-6-hydroxyethyl-amine-S-triazin-2-ylamino）-2，2′-stilbene disulfonic acid]细胞壁染色液。先配制05 mol/L甘露醇，调节pH值为70 （Tris）。再用甘露醇溶液配制VBL，使VBL终浓度为01%。避光，4 ℃保存备用。 　　染色步骤：（1）吸取1 mL细胞悬浮液到15 mL离心管中，吸取10 μL，滴加于载玻片上，在显微镜下观察。（2）吸取400 μL细胞悬浮液至新的离心管中，加20 μL 上述01% VBL，避光，染色5 min。（3）染色后，用CPW溶液重复漂洗3次，以除去背景中的荧光。（4）漂洗后，悬浮于CPW溶液中，避光，荧光显微镜下观察。V